——GJB2 235delC和线粒体DNA 12S rRNA A1555G突变筛查报告
戴朴 刘新 于飞 朱庆文 袁永一 杨淑芝 孙勍 袁慧军 杨伟炎 黄德亮 韩东一
（解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科）
为配合基因医学在耳聋诊断和预防实践中应用的顺利启动和实施，301医院聋病分子诊断中心从2003年起实施前瞻性的全国性聋病分子流行病学调查，以统一的策略和方法在全国不同区域进行大规模重度神经性耳聋的分子病因学调查，为耳聋基因诊断在全国范围开展提供流行病学数据。
1. 病例和方法
1.1 各地区病例采集程序
标准程序和文件建立：由301医院设计耳聋分子流行病学凋查的工作程序．建立标准的工作指导文件程序，保证在不同地区的病例收集符合国内外流行病学调查规范并按同样标准执行。
全国性耳聋分子流行病学调查病例采集网络的建立：确定抽样点，原则上每个省、自治区选择一个有代表性的城市，以此城市或地区的聋哑学校或聋儿康复机构为病例采集地。通过当地耳鼻咽喉科医生、当地教育和医疗口联系安排具体工作办法。
具体方法：由我院外派人员或通过电话、邮件方式指导当地聋哑学校或相应机构进行工作准备，对家长进行宣教．发放调查内容和目的介绍，同时发放家长知情同意书．由家长签署后统一收回；确定工作日程，通知家长到场；当地学校或机构提供体检室、抽血室和测听室；病例采集小组由2～4名有遗传性耳聋病史采集经验的医生、1～2名测听师、1～2名护士组成，同时聋哑学校教师在人员组织、交流上起重要作用。
1.2 病史采集内容
采用问卷调查形式，调查表内容由聋儿基本信息及耳聋史、家族史等组成，由家长填写。并通过面谈或电话方式完善相关信息。基因筛查完成后，阳性病例通过回访完善详细病史。
1.3 体检内容及标本采取
由我院派出的耳鼻咽喉科医师对参选对象进行全身查体，重点检查耳部、智力、发育状况、眼部和其他系统的异常或先天性畸形。由专业人员进行纯音测听检查。由专业护士采取参选对象外周血3～5ml。
1.4 DNA提取及入库管理
采取之外周血保存在4℃条件下，避免震荡，1～5天内送回解放军总医院耳聋基因诊断中心，统一编号，两周内完成DNA提取工作，每份标本提取两份DNA分别储存，除工作液外均保存在-80℃超低温冰箱。按各地区分别建立纸质及电子档案。
1.5 常见耳聋基因突变筛查
选取GJB2 235delC和线粘体DNA 12S rRNA A1555G作为全国性耳聋分子流行病学调查第一阶段筛查对象，方法参见戴朴早先的论文。
2. 结果
2.1 全国性重度感音神经性耳聋基因库的建立
自本项目启动后，作为全国性耳聋分子流行病学调查的组成部分，先期以各省市聋哑学校为基础，已收集来自北京市、河北涿州市和高碑店市、黑龙江牡丹江市、吉林吉林市、内蒙古赤峰市、山西大同市和运城市、河南安阳市、湖北武汉市、陕西西安市、甘肃兰州市、宁夏银川市、青海西宁市、安徽阜阳市、江苏南通市、上海市、福建福州市、广东佛山市、广西柳州市等18个不同省份2065例重度至极重度感音神经性耳聋病例（图1、表1），各地收集病例数由31例至372例，平均每省市收集病例115例。
图1 全国性耳聋分子流行病学调查抽样地区分布图。黄色为标本已采集计完成第一阶段分析区域，黑色为标本已采集地区，红色为汁划收集地区。
由图1可以看出，全国性聋病分子流行病学初步调查暨全国性耳聋基因库的建设已覆盖全国大部分区域，现西南地区和新疆、西藏已基本完成前期工作，2006年即将进行样本采集工作。
2.2 线粒体DNA 12srRNA A1555G突变筛查情况
现已完成全国18个不同省份聋校的2016例非综合征性耳聋病例线粒体DNA 12S rRNA A1555G突变筛查，发现阳性病例57例，检出率为2．83％，各地区检出率有明显的差异（图2），其中安阳、佛山、运域、阜阳、南通、西宁、银川、柳州耳聋患者中的线粒体DNA 12SrRNA A1555G检出率超过全国平均水平，而其它地区耳聋患者中的线粒体DNA 12srRNA A1555G检出率低于全国水平甚至为零（详细数据见专辑内各地区调查文章）。
图2 全国耳聋患者线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变检出率分布图，黑色代表高发区域，红色代表低发区域，黄色代表未检出此突变区域。
2.3 GJB2基因235delc突变筛查情况
在已完成的对全国13个（除上海市、陕西省、青海省、甘肃省、宁夏自治区）不同省份聋校的1680例非综合征性耳聋病例GJB2基因235delc突变的筛查中发现GJB2 235delc纯合突变148例，GJB2 235deIC杂合突变157例，其中235 deIC纯合突变检出率8.8I%，杂合突变检出率9.35%，总突变检出率18 .16%（图3）。
图3 全国耳聋患者GJB2 235delC突变检出率分布图，红色代表高检出地区，黄色代表中等检出地区，黑色代表低检出地区。
其中赤峰、河北涿州和高碑店、北京、大同、南通的GJB2 235delc突变检出率高于全国水平，而柳州地区检出率最低，仅达6.45%，其它地区耳聋患者中GJB2 235delC突变检出率在10—20%之间（详细数据见专辑内各地区调查文章）。
3. 讨论
耳聋基因诊断在临床全面展开的前提条件是对全国各地区耳聋患者群的遗传性耳聋发病情况有深入的研究，对于各种耳聋基因在不同地区的致病率、各种耳聋基因突变的频率和分布、特定耳聋基因突变和多态性的诊断意义有确实的调查数据和统计学分析支持，这样才能保汪耳聋基因诊断在正确的方向支持临床耳科学实践，这也是全国性耳聋分子流行病学调查的发起原因，是这项调查的意义所在。
全国性耳聋分子流行病学调查第一阶段的工作初步揭示了中国人遗传性耳聋高检出率的普遍性。然而，由于中国地域广大，民族众多，造成各地区人群遗传背景复杂，各省市聋校虽然是聋病资源集中的部门，但由于各省市、地区经济发展不平衡，又受交通、信息、防聋治聋意识等各方面影响，聋校聋病资源的构成存在一定差异，使调查结果在反映全国聋病分子流行病学趋势上存在误差。课题组现在正在进行第二阶段的工作，包括各省市地区多点多面聋病样本的采集及边远地区的调查工作、各地区样本的GJB2全序列分析、大样本范围的PDS基因筛查、线粒体重点耳聋相关突变的筛查等，相信随着第二阶段工作的完成，各地区中国人遗传性耳聋的总体情况将得到更精确的体现。
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