过去 20 年来, 单分子成像与操纵领域的进展迅速,孕育出了一门基于观测单个分子来理解生物过程的新学科——单分子生物学。在全世界许多实验室的推动下,这个崭新的领域改变了我们对于许多生物学问题的思考与理解,并产生出很多新知识。

一个早期单分子生物学的例子是我们对胆固醇氧化酶催化的研究1。此酶含有的核黄素辅基在氧化态下是天然的荧光基团,而在还原态下则不发光。每一次荧光的“亮/灭”循环对应一个酶分子催化状态的翻转,从而使得对单个酶分子反应的实时观察成为可能。在单分子层面上,化学反应是随机发生的(即化学反应发生所需的等待时间是随机分布的),而不像在拥有大量分子系统中的反应那样有可被推测的结果。由于很多生物大分子(例如DNA)是以单分子或者少量几个分子的形式存在于细胞之中,能对单分子化学反应进行实时观察就尤为重要。

单分子酶学也具有实际应用意义。?例如,单分子测序仪通过监测单个DNA聚合酶分子将有荧光标记的核苷酸逐个合成到一个单链DNA 模板上的过程,以直接读取DNA分子的序列 2。尽管单分子测序仪在成本、准确性和通量方面还不能与基于大量分子的 DNA 测序仪相竞争,但它的一个独特的优势是能够测很长的 DNA 序列。2007 年以来基于大量分子(而不是单分子)的“ 新一代 ”DNA 测序仪的出现,已开启了激动人心的个体化医疗的新纪元。

然而在基础研究领域,单分子生物学不仅在体外而且在活细胞内均增进了我们对许多大分子系统工作机理的深入理解。一个基因在单个细胞中只有一个或者两个拷贝,基因表达的过程和单个酶分子反应一样,也是随机发生的。因此,单分子生物学与单细胞生物学是密切相关的。近年来,我们对单个活细胞中mRNA和蛋白质分子逐个产生的随机 过程进行了详细的研究,从而使得分子生物学的“中心法则”在单分子层面上得到了定量的描述 3。

DNA以单分子(单个染色体)的形式存在于每一个人体细胞中,所以基因组的变化也是随机发生的。相应的,人类生殖细胞分裂时发生的随机重组使得每一个细胞都不相同,而癌细胞中剧烈的基因组变化也使得原发肿瘤中的细胞之间存在高度的异质性。在一个细胞中最常见的基因组改变包括单核苷酸变异 [SNV,一种单碱基对的点突变;基因拷贝数变异(CNV)]。在人类整个基因组的六十亿个碱基对中的一个特定的SNV就可能导致遗传性疾病;而 CNV 通常发生在生殖细胞分裂时的染色体分离过程中以及肿瘤细胞内基因组的重排错误(包括插入、缺失、染色体倒位和易位)。由于SNV和CNV在不同细胞中的发生是随机的、不同步的,因此每个细胞都拥有不同的基因组,这使得单细胞测序成为必需。而直到最近,由于单细胞基因组学的发展,这种必需才变得可行4。

给单个人类细胞做全基因组测序需要对其进行全基因组扩增(WGA)。新近发展的一种 WGA 方法——多重退火循环扩增法(MALBAC)5,可以比此前广泛应用的MDA方法更准确地检测SNV和CNV。MALBAC 可以在人体细胞中数字化地计数一个基因的拷贝数,并且能够没有假阳性地检测单个SNV(虽然可能会有一定的假阴性)5。

最近,我们把 MALBAC 用于协助人工辅助生殖和癌症的研究,两者皆对精准医学有着重要意义。在人工辅助生殖领域,为了避免染色体异常和单基因疾病的遗传,MALBAC 已经被应用于胚胎植入前基因组筛查(PGS)和胚胎植入前遗传学诊断(PGD)6。染色体异常(即染色体层面上的拷贝数变异)是流产及许多遗传性疾病(如唐氏综合征)的主要致因。同样,约7000种单基因遗传疾病会严重影响人类健康,并对病人家庭和社会医疗体系产生沉重负担。

虽然PCR、荧光原位杂交(FISH)和 DNA微阵列芯片等方法都已经被用于PGD 和PGS,MALBAC能够提供更高的精确度,并可以同时避免染色体异常和危险点突变的发生。2014年,随着两个“MALBAC 婴儿”的出生,我们成功地利用了MALBAC来筛选健康胚胎,使婴儿基因组中避免带有父母中一方所携带的遗传疾病基因7。这为患有遗传性疾病(或 携带遗传疾病基因)的夫妻带来了福音, 他们现在可以以很高的成功率避免将那些具有严重危险的突变传给下一代。

在这两个病例中, MALBAC 极低的假阳性和假阴性率完美地满足了父母希望后代不再携带严重的杂合致病突变的要求。类似的方法可以减少某些疾病(如乳腺癌)在下一代中的遗传风险。选择一个风险较低的等位基因(如特定的 BRCA 基因序列)在技术上是可行的,但在伦理层面上还需进一步讨论。

众所周知,癌症是一种基因组疾病8。循环肿瘤细胞(CTC)在进入外周血液循环后可能介导癌细胞的转移,并导致 90%与癌症相关的死亡。MALBAC方法也被用于单个CTC 细胞测序。与癌症高度异质性的点突变不同,通过分析肺癌患者的单个 CTC 基因组,我们发现 CTC的CNV模式在一个病人体内以及在患同一种癌症的不同病人中是相似的, 但在不同的癌症类型中是截然不同的。此外,这些CTC中重复出现的CNV模式 与患者的转移灶肿瘤细胞 CNV 模式也是一致的9。显然, 染色体特定区域拷贝数的增减模式被肿瘤转移所选择。循环肿瘤细胞CNV 模式与癌症类型有关这一发现为我们提供了基于CNV模式进行无创癌症诊断的可能。因此,单细胞全基因组扩增方法的进一步发展将使我们不仅能够更好地了解肿瘤异质性和癌症转移的机制10,而且有望实现对癌症的个体化诊疗。

总结

DNA以单分子的形式存在于每个细胞中,因此基因表达和基因组的变化是随机发生的,这也使得在单细胞和单分子水平上的测量成为必需。单细胞基因组学发端于单分子技术与基因组学的交汇之处。在单细胞中进行精确基因拷贝数的计数以及基因点突变的检测现在不仅已成为可能,而且正在成为日益重要的技术。这些手段使得我们能够在单个分子的层面上检测、理解并改善生命过程,也为我们提供了“精准医学”的生动案例。

致谢:我很感谢我目前和过去研究组所有成员以及合作者的贡献,特别是乔杰、汤富酬、陆思嘉博士在人工辅助生殖项目上的贡献,王洁、白凡、张宁博士在循环肿瘤细胞项目上的贡献。（来源：北京大学生物动态光学成像中心）JAMA综述原文（英文）下载