生物体的生长发育、损伤应激、免疫应答，以及体内细胞分化凋亡等一切生命活动由各种各样的过程所调控。其中泛素化及其“逆过程”去泛素化就是重要的调控机制，它们在体内形成动态平衡，并几乎参与了所有的生命活动。由于这两个过程与肿瘤、心血管等疾病的免疫与发病机制密切相关，近年来，已成为研究热点与重要药物的新靶标。
病原菌在与宿主长期的相互“斗争”中，会分泌一些具有去泛素化酶活性的“坏蛋分子”，干扰宿主泛素化过程，降低宿主免疫能力并促进病原菌的“侵袭”。一直以来，探索新型去泛素化酶及其功能与作用机制，是科学家最为关注的话题。
近日，浙江大学
研究院朱永群教授团队在国际上首次发现了一个来源于名为“嗜肺军团菌”的病原菌中特异地切割线性泛素链的全新去泛素化酶，并揭示了其在病原菌与宿主相互作用中的重要功能及机制。相关研究成果发表于《自然—微生物》杂志。
一个长期的科学疑问
在人、动植物等真核生物的细胞中广泛存在着泛素分子，它们是“路标”，指示着需要被降解的蛋白质或者发出特定的信号转导方向。而泛素分子会通过泛素化过程，在泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶的依次催化下，会形成不同连接形式的多聚泛素链，包括异肽键连接的泛素链和泛素分子“首尾相连”的线性泛素链，参与调节信号通路。
“线性泛素链作用很重要，其拥有独特的构象，只能被一些特殊的蛋白识别，从而介导很多重要的信号通路调节，影响重要的生理过程，如细胞凋亡，胚胎发育、自噬等。”朱永群告诉《中国科学报》。
与此同时，真核细胞内还存在着大量的去泛素化酶，与泛素化“针锋相对”，它能够切割泛素链，释放泛素分子并在“有需要的地方”被循环利用，因此，去泛素化酶在信号转导过程中发挥着关键的“调节器”作用。
已有研究表明，这些去泛素化酶主要是针对异肽键的泛素链，针对线性泛素链的就只有一个名为OTULIN的特异切割的去泛素化酶。
不过，对于“OTULIN”如何起作用，科学家们之间莫衷一是。
朱永群表示，OTULIN虽然能够“切割”线性泛素链，但有人认为它直接具有去泛素化酶活性，有人认为它只是作为一个“调节分子”，催化一个特殊的泛素连接酶LUBAC活性，使其起作用。“两种观点分别发表在《自然》和《细胞》两家顶级期刊上，争议很大。”
阐明相关机制很重要，因为在病原菌与宿主的“斗争”中，线性泛素链参与宿主免疫防御过程，具有很强的抑制细菌侵染的能力。朱永群进一步解释道，细菌“入侵”宿主之时，会分泌大量的毒性效应蛋白，也就是“毒素”，毒素进入细胞便开始“鸠占鹊巢”，它作用于宿主细胞关键信号分子，改变宿主正常的信号通路，拮抗宿主免疫防御和促进病原菌侵染，从而顺利“存活”。
过去的研究已经发现了多个具有去泛素化酶活性的效应蛋白，但全部都是切割异肽键连接的泛素链，“是否存在特异地切割线性泛素链的去泛素化酶效应蛋白？这是病原菌领域里长期以来存在着一个科学疑问。”朱永群说。
一个简单新颖的实验
“这个很难做。”朱永群坦承，病原菌不计其数，其分泌的效应蛋白也成千上万，谁具有切割线性泛素链的去泛素化酶活性呢？
朱永群团队设计了一个“简单”却很“新颖”的实验。
此前，他们研究发现，病原菌只有与宿主细胞接触时才会分泌“毒素”。而事实上，当病原菌生活在营养充足并开始快速生长的后对数生长期时，效应蛋白就已经被表达了，只不过尚未分泌出来而已。
由于泛素和泛素链只存在于真核生物中，研究人员设想，如果将病原菌培养到后对数生长期，将其制备成细菌裂解液，然后利用它在体外切割泛素链。“病原菌细胞裂解后，效应蛋白释放在试管中，如果裂解液能够将泛素链切割成单个泛素分子，表明该细菌裂解液具有去泛素化酶的活性。”朱永群说。
随后研究人员根据这一设想建立了实验体系，利用这一筛选体系，对43种不同的病原菌进行筛选，成功发现嗜肺军团菌的裂解液能够切割线性泛素链，表明嗜肺军团菌含有切割线性泛素链去泛素化酶活性的效应蛋白。
“这很有意思。”朱永群说。嗜肺军团菌就是人类“空调病”的病原菌，它常存在于空调的冷凝水中，被人呼吸到肺部后，就会在肺部里面‘干坏事’。它分泌300个毒性效应蛋白到宿主细胞中，在巨噬细胞内，嗜肺军团菌建立了独特的膜泡结构作为“大本营”，在里面大量增殖，最后导致巨噬细胞死亡，被释放出来的细菌再进行新一轮的感染。“当巨噬细胞死亡的越来越多，就会引发‘空调病’。”
然而，究竟是嗜肺军团菌中哪个效应蛋白切割的线性泛素链？研究人员从该菌中克隆了149个功能未知效应蛋白，在体外进行针对线性泛素链的去泛素化酶活性实验，成功筛选出唯一的一个名为RavD效应蛋白。随后的实验表明，RavD只特异地切割线性泛素链，对其它类型的泛素链不起作用。
一种新工具
“RavD效应蛋白是一个全新的去泛素化酶。”朱永群表示，通过解析它的结构，发现RavD具有独特的三维结构，不同于先前发现的所有去泛素化酶。
更重要的是，研究人员发现RavD被嗜肺军团菌分泌后，会持续性地切割膜泡上形成的线性泛素链，避免膜泡上线性泛素链的累积，达到抑制宿主NF-κB免疫信号的目的。这样的结果导致，已被感染的细胞无法发出“求救信号”，处于一种仍然“健康”的假象中。
事实上，不止是在嗜肺军团菌中，RavD广泛存在于军团菌属细菌中。
与前述争议较大的OTULIN不同，RavD有望被开发成研究线性泛素链的全新工具，促进真核细胞信号转导的研究。
“未来，我们希望对我们发现的独特效应蛋白进行蛋白工程上的改造，使它们能成为生物医学研究和临床诊治的工具。对于一些感染至关重要的效应蛋白，我们希望能帮助研发新型抗菌药物，解决日益严重的病原菌耐药性问题。”朱永群说。
相关论文信息：10.1038/s41564-019-0454-1
