导读
相干拉曼散射（CRS）技术能够大幅提升拉曼散射的信号强度，其通过探测分子固有的振动模式，无需标记即可得到待测样品中的特定化学键信息。因此，近年来以“受激拉曼散射（SRS）”和“相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）”为代表的相干拉曼散射技术受到了研究人员的青睐。然而，虽然已经存在多种多样的SRS和CARS激发策略，但目前相干拉曼散射的光谱分辨率却始终逊于作为金标准的自发拉曼光谱。这一问题源于激光脉冲时域与频域之间的不确定性关系——随着脉冲变短，非线性效应增强，虽然探测灵敏度能够提高，但频域测量的光谱分辨率势必会降低。鉴于此，拉曼光谱领域长久以来都希望能够开发一种兼具高灵敏度与高光谱分辨率的CRS光谱及成像方法。
近日，北京大学未来技术学院国家生物医学成像科学中心的熊汗青老师课题组报道了瞬态受激拉曼散射（TSRS）光谱与成像方法。该团队采用宽带飞秒激光操控时域振动波包的干涉,在亚毫摩尔的灵敏度下得到了接近自然线型的高质量光谱。随后，该团队演示了TSRS高光谱成像在监测活细胞代谢方面的应用，并初步构建了适用于TSRS的高密度拉曼探针组和条形码标记成像。相关成果以“Transient stimulated Raman scattering spectroscopy and imaging”为题发表在《Light：Science & Applications》上。
研究创新
传统CRS技术通过调节皮秒级激光的波长来得到对应区域的光谱信号。该工作则采用时域激发策略，通过扫描飞秒激光脉冲对间的延时，检测连续激发的分子振动波包干涉对受激拉曼损耗信号的调制，通过傅里叶变换得到对应的频域光谱。这一时域激发策略巧妙绕过了频域方法的不确定性制约。通过小幅增加采样积分时间，TSRS技术兼具了自然光谱线宽极限的光谱分辨率与亚毫摩尔级别的高探测灵敏度。与此同时，由于采用了傅里叶变换极限的飞秒脉冲激光，可同时激发多个拉曼模式。TSRS光谱天然具有高光谱的特点。
图1 TSRS的激发原理和系统简图
研究团队分别对活海拉细胞中的脂质蛋白区域（2800-3000 cm-1）、细胞指纹区域（1580-1700 cm-1）和细胞静默区域（2050-2200 cm-1）进行了高光谱成像，见图2。具体来说，在得到细胞图像的同时，所有像素点都可以单独重建得到其对应的拉曼光谱。由于同步采集空间信息与光谱信息，细胞内部代谢物质的化学变化可以通过重建的光谱监测。在不对生物样品造成损伤的激光功率下，得到了信噪比较佳的图像与对应光谱。
图2 TSRS在各光谱区域对活海拉细胞进行高光谱成像
为了进一步体现TSRS超高光谱分辨率以及宽带飞秒激发的优势，研究人员从已有的小分子库挑选了具有窄线宽氰基和炔基的小分子组成高密度多色拉曼探针组，见图3。TSRS光谱与成像展示了区分相邻的拉曼探针光谱间距在12 cm-1左右的光谱成像，理论上在100 cm-1的光谱范围内就可以实现八色成像。随后，研究人员将这些探针嵌入聚合物微球中，初步展示了探针组构成的拉曼条形码样例。相较于传统的荧光标记策略，TSRS条形码编码与解码方案的编码数目显著增加，有望大幅提升标记与检测通量。（来源：LightScienceApplications微信公众号）
图3 高密度拉曼探针组与其构建的聚合物微球拉曼光谱条形码
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-024-01412-6
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