论文标题：Nanofluidic Immobilization and Growth Detection of Escherichia coli in a Chip for Antibiotic Susceptibility Testing

期刊：Biosensors

作者：Jan F. Busche et al.

发表时间：26 Janurary 2020

DOI：10.3390/bios10100135

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期刊链接：https://www.mdpi.com/journal/biosensors

面对细菌病原体，越来越多的抗生素失去了原有的效力，抗生素耐药细菌感染对全球医疗保健构成的威胁正在逐渐增加。据研究，全世界每年约有70万人死于多重耐药性感染。若想对抗生素的有效性做出可靠的评估，就必须进行快速的即时诊断。这可以通过快速的表型微流控测试来实现，该测试可以应对低细菌浓度且非标记条件下的研究。

近日，德国布伦瑞克工业大学微技术研究所的Andreas Dietzel教授及其团队在Biosensors 期刊上发表了一篇文章，文章提出了一种新型的具有交叉流固定原理的光流控芯片，该芯片使用规则的纳米间隙阵列来浓缩细菌并通过干涉法测量细菌在抗生素影响下的非标记生长。这项研究描述了光流体纳米系统的制造和表征，并展现了纳米流控芯片法在快速非标记的抗菌药敏感性试验的应用潜力。

实验原理

纳米光栅芯片概念

如图1所示，流体光栅由两组微通道阵列组成，微通道阵列交错放置形成非对称测量光栅和参考通道。当用准直的激光束 (红色) 照射时，非对称光栅会产生衍射图。当细菌被捕获在检测通道 (绿色) 时，会产生与参考通道不同的折射率，进而可在sCMOS传感器上检测到信号变化。

图1 芯片上的微流体通道（黄色和绿色）和垂直对准光栅的准直激光束（红色）的示意图

光流控测量装置

如图2所示，芯片上的流体流动和细菌负载由八个气动控制器实现，这些控制器通过聚四氟乙烯 (PTFE) 管连接到八个样品瓶 (D_1.1至R₈)。为了实现细菌捕获和生长模式之间的切换，实验中使用了三通阀。流体装置集成到光学装置中，且被不透明的外壳包围。

图2 （a）流体装置示意图，检测通道（D1.1至D4）和参考通道（R5至R8）的样品容器以及一个在捕获和生长模式之间切换的三通阀；（b）纳米流体芯片的微观俯视图。

芯片的制备

纳米光栅芯片采用光刻和相应的混合气体干蚀刻工艺制作。根据流体通道在光栅中的位置不同，形成光栅的流体通道长度在910到1016 μm之间。光栅由24个检测通道和24个参考通道组成。制作的芯片大小为10 mm × 10 mm。由于使用了玻璃和硅，芯片可以完全清洗，可重复使用。

图3 (a)纳米流体光栅芯片制造步骤示意图。

实验结果与讨论

荧光生长实验

为了确定细菌是否已被固定且生长在纳米光栅中正确的位置，研究者使用荧光显微镜和延时成像进行了生长实验。图4显示了芯片加载完成后间隔30min的荧光图像。图像显示细菌开始从纳米间隙区域的起点生长到光栅的中间，并成功地被间隙阻挡了4h。用绿色荧光蛋白GFP标记的细菌进行的实验可以表明，在整个实验过程中，没有大肠杆菌进入间隙或参考通道。

图5 (a)单个通道荧光区域F随时间变化图；(b)荧光区域随时间变化的平均值MF。(c)线性拟合的平均面积MF随时间变化的对数图，以确定细菌的生长速率。(d) 在生长实验中，每隔30分钟拍摄4小时的荧光图像。

衍射信号测量生长检测

为了测试光流控纳米光栅芯片能否检测抗生素对固定化细菌生长的影响，进行了具有衍射信号评估的生长实验。在无有效抗生素和有有效抗生素的情况下进行生长实验，分别向培养基中添加200 μg/mL卡那霉素。图5是激光衍射在由检测通道和参考通道组成的纳米光栅上所产生的随时间变化的信号路线。最初，信号的上升是因为芯片上充满细菌。将阀切换到生长模式后，可以观察到指数信号的增加，这表明在无卡那霉素的实验中有细菌生长。相反，在添加卡那霉素的实验中，信号保持恒定的低水平超过4h。由于使用的细菌菌株对卡那霉素具有敏感性，可以认为无细菌生长。

图6. 在有和没有添加200 µg/mL卡那霉素的情况下生长实验的衍射信号的时程，用指数拟合法测定无卡那霉素实验中细菌的生长速率。

结论

这项研究在一种新型流体芯片上演示了纳米流体细菌捕获和生长的干涉测量。实验结果表明，细菌能够在正确的位置被捕获，制备的光流控纳米光栅芯片能够成功检测抗生素对固定化细菌生长的影响。使用三通阀的光流控装置可以方便地在捕获模式和生长模式之间切换，确保在后续测量过程中无需进一步加载即可检测生长。通过改进测量装置提出的检测原理有希望应用于抗菌药敏感性试验 (AST) 的即时医疗设备。

Biosensors (ISSN 2079-6374, IF 3.240) 是一本国际型开放获取期刊。涵盖DNA芯片、微流体装置、纳米生物传感器及其应用、生物传感器制造、生物传感器材料、芯片实验室技术和生物传感器在生物医药、食品质量与安全等领域的应用。目前已被SCIE、Scopus、Inspec (IET)、MEDLINE (PubMed) 等重要数据库收录，Biosensors采取单盲同行评审，一审周期约为13.1天，文章从接收到发表上线仅需2.7天。