细菌耐药的问题已经成为全人类面对的难题之一。

发现青霉素的科学家亚历山大·弗莱明早就预言，人们若因无知而滥用青霉素，就要在道德上为他人的死亡负责，因为无知带来的耐药问题，会导致其他人因此而丧命。

“如果我们无法在2050年前控制现在的情况，到那时，全球每年因耐药导致死亡的人数会上升到1000万。” 国家卫健委抗菌药物临床应用与细菌耐药评价专家委员会办公室主任徐英春表示。

其中，解决抗生素抗性基因（ARGs）在环境中迁移扩散的问题，更值得关注。

“ARGs会随着基因的水平转移传播至病原菌中，人类若感染了具有耐药性的病原菌，一般的抗生素治疗就会失效。如果一种病原菌获得了不同类型的ARGs，那么它可能会成为‘超级细菌’，届时将导致无药可用。”近日，中国科学院城市环境研究所研究员崔丽在接受《中国科学报》采访时表示。

但，科学家尚不清楚ARGs从环境到临床病原菌的传播轨迹以及ARGs传播风险。

利好的消息是，最新一期的《分析化学》发表了崔丽团队一项关于ARGs水平转移的研究，为预防高风险ARGs的传播提供了新指导。

阻断ARGs传播应在源头

采访中，诸多专家表示，耐药其实是一个自然过程，但是人类要为这一过程的加速承担责任。因为抗生素不仅在医学方面，在农业、畜牧业、水产业都有使用。

“滥用越多，细菌耐药性就越强。”WHO抗微生物耐药性技术战略专家顾问组成员吴永宁表示，抗生素在环境中大量蓄积，会污染并破坏人类生存的环境。

比如，抗生素残渣、抗生素的废水排放到环境中，会导致土壤和水中的细菌产生耐药性，而耐药性的基因可以形成水平和垂直传播，进而影响到人类。

“而解决阻断ARGs传播就应该在‘源头’控制。”上述研究论文的第一作者、中国科学院城市环境研究所博士李弘哲举例说，比如，减少抗生素的使用，以降低抗生素的环境流入量以及环境微生物因进化而产生耐药性的概率。另外，在畜禽粪便还田前，也要经过堆肥处理，以降低耐药菌的直接流入等。

但现实情况是，环境中存在大量胞外DNA，这些DNA中携带的ARGs便会通过转化的方式水平转移至人类病原菌中。

当然，转化是其中一种常见的方式。“它还会通过菌-菌接触发生接合转移过程、噬菌体介导的转导过程、囊泡介导的转移过程等方式发生水平基因转移。”李弘哲说，环境中不同抗生素抗性基因的转移轨迹和传播风险也是不同的。

那么，寻找高效的耐药风险监测手段阻控ARGs传播就显得尤为重要。

研发新手段能高效识别

“此次研究的转化是一种常见的水平基因转移过程，其重要前提是，有方法能快速准确区分接收了抗性基因质粒的转化子与未接收质粒的敏感菌细胞。”崔丽说。

在具体研究过程中，该团队发展了一种新型的拉曼光谱结合重水逆向标记的手段，实现了抗生素压力下抗生素抗性菌与敏感菌的准确区分，即预先氘标记的抗性菌在抗生素压力下会快速代谢体内的氘，在拉曼光谱下C-D峰完全消失，敏感菌则反之。

“相比我们之前发展的拉曼重水正向标记，该方法具有更高的灵敏度和分辨率等优势，更适于从大量受体细菌中，识别出少量的转化子。”崔丽表示。

并且，由于实现了单细胞水平检测，该方法还不受细菌可培养性限制，克服了传统培养方法低估转移频率的缺点。

研究人员首先将该方法运用到感受态大肠杆菌与氨苄质粒的模式转化体系中，无C-D峰的转化子被拉曼识别和分选，并检测出了氨苄抗性基因。

“这就说明无C-D峰菌占总菌的比例可作为抗性基因转化风险的指标。”李弘哲说。

李弘哲正在做实验。

在此基础上，该研究团队又将土壤DNA与感受态大肠杆菌进行转化实验，并研究了多种临床抗生素相关抗性基因的转移效率。

“我们发现，氨苄类抗性基因的传播效率（风险）高于环丙沙星与头孢拉定类抗性基因。但庆幸的是，最后一道‘防线’抗生素美罗培南与万古霉素类的抗性基因的转移风险最低。”李弘哲表示，单细胞拉曼光谱结合重水逆向标记的方法能从抗性表型水平研究环境中可转移的抗性基因的类型以及传播风险，为环境抗性风险评估提供了一个新手段。

期待全面评估传播风险

李弘哲告诉记者，在研究中，他们遇到的最大困难是，如何验证拉曼识别的转化子携带的抗性基因。“为此，我们利用单细胞分选技术，将拉曼识别的单个目的细菌进行了分离扩增，并明确了抗性基因的存在，为该方法的可靠性提供了最为直接的证据。”

在审稿过程中，审稿人对此项研究的意义、创新性和技术质量都给出了很高的评价，比如，“我认为Raman-rD2O确实是研究ARGs转化的一种有用方法。” “这为计算传播的频次提供了更为简便的方法。”。

当然，也有审稿人提出，如何准确地评估抗性基因水平转移风险的问题。

“我们起初以抗性基因的转移频率作为衡量指标，但没有考虑不同质粒进入细菌后的适应度代价，即携带不同质粒后，微生物的生长会受到很大影响，从而带来不同的传播风险。”李弘哲说。

为此，研究团队纳入了孵育过程中细胞增殖这个因素，直接以转化子的丰度作为“转化效率”。由于该方法兼顾了转移频率和生长速率，转化效率被认为能更准确评估抗性基因的转播风险。

这一解决方法，回答了审稿人提出的意见。

“未来，我们希望围绕人与环境大健康这一目标主题，将拉曼光谱结合重水逆向标记的方法，运用到接合和转导等多种抗性基因水平转移过程的研究，并深入解析哪些环境抗性基因可以传播，可传播抗性基因的宿主来源问题以及这些抗性基因是否与临床相关等，进而全面评估不同环境抗性基因的传播风险。”崔丽说。

相关论文信息：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c03218