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要想测定神经元中的电荷变化，最常用的方法是在培养皿中将金属电极插入大脑切片中，或者直接插入活体动物的大脑，这种方法已经被研究员使用了50余年。长期以来，波士顿大学医学院药理学教授David Farb等研究者也在逐步扩展这些方法的潜力。“我早先开始进行电生理学研究时，使用的是真空管放大器。”Farb解释道，“一名研究员可能要花一整天才能得到一个细胞的记录，而且可能第二天毫不奏效，因此推进得很慢。”
经过一系列长期的改良，Farb和他的同事现在可以在动物正常活动的同时完成整个脑部区域的活性检测。尽管这一工作仍然冗长乏味。
每次实验，Farb的实验室都要制作一种多层设备。首先，他们要将四个电极装入一个称为 “四极管”的设备，大约相当于一个人头发丝的直径。德国吉森的Thomas Recording公司和位于佛罗里达州阿拉楚阿的Tucker-Davis科技公司，销售预制的四极管和相关设备，但是资源有限无法购买这类设备的研究者通常会自己制作这些设备。Farb解释说，他有一个小车间，其中全是本科生在不断地制作这种一次性的四极管，“因为我们买不起这些” 。
然而，无论是购买还是制作四极管，使用起来都需要耐心，以及如做手术般老练的技能。二三十个四极管连接在一个称为“前置器”的顶部，该装置包含一组微驱动器（安装控制四极管的支架）。微驱动器上有一些小螺旋钻，研究人员每天只能旋进一小段，以避免伤害脑组织。这个过程可以让四极管缓慢地进入大鼠或其他动物的脑部目标区域。
对于能够掌控多路复用电极的人来说，它可以产生宝贵的数据。Farb的实验室已经追踪了“位置细胞”的网络，显示动物如何在不同环境中进行导航，该发现可以阐释一切，从最基础的学习机制到老年痴呆症的发病机理。
不幸的是，由于小鼠体型太小，无法容纳这个领域的标准设备，因此在有意识的动物身上进行电极分析一般都会限制于非人灵长类动物，偶尔可以在大鼠身上实现。位于弗吉尼亚州阿什本的霍华德·休斯医学研究所Janelia 研究园区的团队负责人Joshua Dudman想要改变这一现状。“我当时真的去找现已去世的祖父，他曾是一名设计化油器的机械工程师，我们互相交换了一些想法。”Dudman说。
位于马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院（NIH）国家眼科研究所的杰出科学家Robert Wurtz曾为猴子研发出类似的系统，他提出了一些额外的建议。有了Wurtz的建议，再加上在鸡尾酒餐巾纸上画出的方案，Dudman开始为探究小鼠的大脑制作一个标准的系统。他的团队使用3D打印机来制造安装支架，用来固定电极并且保持动物的头部位置。他们通过与Janelia研究园区的另一个研究组合作，随后改良了过去一种基于硅芯片电极矩阵的设计，进而制作出了啮齿动物体外/体内电生理学靶向系统（RIVETS）。正如名字所示，RIVETS利用单一、标准化的组件，就可以研究活体动物或大脑切片。它同时也能利用双光子显微镜来进行同步成像。
除了3D打印的部分之外，RIVETS也使用大部分神经生物学实验室都具备的现成仪器。“其中一大问题是你如何将它与仪器的其他部分结合起来。如果我们想要进行准确的定位，我们不想去重新制作显微操纵器，因为很多不错的公司已经制造出非常高端的产品。”Dudman说。显微操纵器是经过精密加工的设备，通常与显微镜平台连在一起，利用手柄或操纵杆就可以让研究者移动小组分，例如将电极移入某个位置。
科学家可以在Dudman的网站上下载3D打印的文件及其他信息，并且使用来自诸如英国东萨塞克斯郡的Scientifica公司或者加州诺瓦托Sutter公司的显微操纵器。Dudman接着说，Scientifica公司近期购买了一份非排他性许可证，向倾向于有商业支持的产品的科研人员销售成套的RIVETS系统。
Dudman并不是唯一一位想要为小鼠打造更好的头盔的人。“我们在实验室的主要创新是制作超轻但也超稳定版的慢性电生理学植入方式。” 位于罗德岛州普罗维登斯的布朗大学神经科学副教授Christopher Moore说。
对于想要研究小鼠大脑的团队来说，减轻重量非常关键。“哺乳动物的遗传工程和体内系统革命是一个巨大的恩赐，但是这都来自于小鼠，它们可是小个子。”Moore说。他利用新阵列解释道，“现在你所做的生理学实验只能在大鼠或猴子身上完成，但已经能够被小鼠更好地适应。”
探究大脑
无论是用于体内或是体外，电极丝一般都能测量神经元组织之间的电荷变化。膜片钳作为一种互补的技术，使用微小的微毛细管来追踪单个神经元中离子通道的波动。
对于初次使用膜片钳技术的人来说，第一步应当回顾基础电子学。“做膜片钳的工作，最终你是将神经元看作一种电子设备，了解这种电子设备是如何工作的，以及如何在生物学中应用这些原理，我认为这是极其重要的。”俄克拉荷马州诺曼的俄克拉荷马大学生物学助理教授Michael Markham说。Markham正在维护一个称为“神经元的电生理学”的免费软件包，用于辅助这一过程。
在所有电子学的挑战中，Markham指出，毛细管进入动物脑部越深，它的内阻和电容也就越高。这意味着，深部探针与较浅的探针相比，带宽更少。
将毛细管植入膜片钳实验的活体动物大脑，所需的操作很棘手，要求特别谨慎的手术技巧。马萨诸塞州坎布里奇的麻省理工大学（MIT）合成神经生物学研究组组长Edward Boyden决定，将这项工作交给机器人来做。“我们研发了一种算法，让你可以对神经元进行膜片钳操作，并且也可以利用计算机进行自动化操作。无须依靠人的直觉。”Boyden说。
Boyden的团队将该算法用在一个机器人身上，缓慢地将膜片钳毛细管插入动物脑部的目标区域，直到检测到电阻的升高，这就意味着毛细管已经遇到了一个神经元。随后，机器人可以附上毛细管，不仅检测神经元中离子通道的活性，还能提取细胞质用于生化分析。
在发表这项技术后，研究人员同时创立了Neuromatic Devices公司，目前销售自动化的膜片钳设备，便于他人复制这项技术。Boyden也想要在活体动物中对神经生理学的其他方面进行自动化。“我们认为，我们无意中发现了人们可以称为‘活体机器人学’的领域，我们可以在此当中部署一系列的技术，对这种过程进行自动化并提供解决方案。”他说。
同时，Moore的团队也在试着让电极生理学变得更便利。Moore 实验室的研究生Jakob Voigts打造了一批基于开源许可的标准电生理设备。该计划称为Open Ephys，让研究人员可以仅用相当于数千美元的零件，就能组装一台精密的神经生理学装置。在线支持可以帮助使用者解决出现的任何问题。
奇思妙想
除了让它更易于检测神经元活性外，Boyden也帮助开拓者在实验方法上寻找激活神经元的新方式。这个创新点源自于他在传统药理学和电刺激方法中的失败，这两种方法都不是很精确。“你不能只激活一部分特定的神经元。”Boyden说
通过检索文献，他和同事找到了一条不错的线索。“2000年春季我们在进行头脑风暴，我们无意间注意到几篇所谓微生物视蛋白的文章。” Boyden解释道。该团队特别感兴趣的一点是感光视蛋白，能够在光反应下打开微生物细胞膜上的离子通道。当研究者通过遗传修饰动物的神经元去表达其中一个蛋白时，神经元开始在光脉冲下展现出活性。自此以后，Boyden的研究组和其他人开始持续地改进该技术——称之为 “光遗传学”，这项技术目前已经成为在活体动物和大脑切片中探索神经生理学的标准工具。
光遗传学最新的发展包括对红光敏感的通道蛋白（能够深入到大脑组织中），以及光敏感的氯离子通道（能够在光反应中抑制神经元而不是刺激神经元）。巧妙的小鼠遗传技术也使得科学家能将光敏通道的表达限定在非常具体的大脑区域中。结合这些技术，研究人员目前能够将光穿过小鼠完整颅骨，并且高度精确地激活或者抑制目标神经元群体。Boyden说，“该工具真的已经开始得到很常规的使用。”
光学的戏法也可以进一步探索光遗传学的可能性。例如，研究人员目前能利用多光子全息图在动物脑部激活单个的神经元。“你可以真正地试着去控制神经编码中复杂的三维构型，然后这将可以用于检测神经编码中非常具体的假设。”Boyden解释道。
同时，光遗传学也很好地与电生理学相融合。电极丝放置的一大传统挑战是找到电极在动物大脑中的位置，利用光遗传学，研究者现在可以确定这个信息。“当你打开光时，你能够清楚地看到你利用金属电极分离的神经元是否是（正确的类型）。”布朗大学的Moore说。
Moore的实验室甚至解决了如何结合光遗传学与另外一项神经科学家所钟爱的工具——功能性核磁共振成像（fMRI）。通过揭示整个大脑的血流变化，fMRI可以给出对刺激反应的概况。光遗传学现在能够提供非常准确的刺激。“你能够在某个特定的点对特定的细胞类型进行刺激，例如说新皮层的手上的代表区；然后你可以用fMRI去说，‘当我只刺激了该位置的这类细胞时，大脑中还有哪些区域被激活？’”Moore补充道，“这是非常了不起的信息。”
除了自身的优点外，光遗传学也存在一些缺陷。对于大多数准确的细胞激活来说，研究者仍然不得不通过颅骨在小鼠大脑中插入光纤。密歇根州芒特普林森的中央密歇根大学神经科学副教授Ute Hochgeschwender正在尝试另一种不同的策略。“避开使用物理光纤的一种方式是，如果我们可以基本上使用一种生物学的光源。” Hochgeschwender说。
Hochgeschwender和她的同事融合了萤火虫的荧光素酶蛋白与感光视蛋白和荧光蛋白质结构域。得到的荧光视蛋白（luminopsins）在光反应下打开了离子通道，在提供了恰当的荧光素酶底物时可以发射光线，并在荧光显微镜的检测下发光。研究人员可通过光照或者向动物注射荧光素底物来激活靶向神经元，荧光标签将揭示哪些细胞正在表达这些蛋白。“任何视蛋白，任何研发出的光遗传学元素，我们都能提供用化学方法得到的另外一个维度。”Hochgeschwender说。
在最近的技术迭代中，Moore和Hochgeschwender正在利用钙敏感荧光素酶，合作创造一种同时需要底物和钙离子来激活的系统。发光使得钙流向了神经元胞浆中，因此“你能够想象这种系统，在底物存在的情况下，真正的神经元活性会打开光亮。” Hochgeschwender解释道。
然后，研究人员可以鉴定发光的细胞，甚至是在保持颅骨完好的情况下。Hochgeschwender展望了一种新的策略——科学家在进行实验前就能够找到哪只小鼠正在正确的细胞中表达蛋白，排除不恰当的表达模式，从而在实际上减少实验所需的动物数目。
不过，无论科学家使用电极还是生物荧光酶，与新一代技术打交道的科学家掩饰不住对潮水般涌来的新进展的兴奋。就像Farb所说的，“现在我感觉自己像个孩子，我们正在不断出成果，我就会说，‘哇，我简直不敢相信这个，我从未想过这个，我从来不敢想像它。’”■
（译者之一高大海系中国科学院海洋研究所助理研究员）
Alan Dove 是来自马萨诸塞州的科学作家和编辑。
DOI: 10.1126/science.opms.p1500098
