结构生物学领域迎来“不结晶”革命

冷冻电镜通过揭示细胞隐藏机制开启一场风暴

如果继续发展下去，并且所有技术问题都得到解决，冷冻电镜确实会成为一种占据统治地位的技术，而不仅仅是第一选择。

图片来源：Viktor Koen

在英国剑桥市一座钢结构建筑深处的地下室里，一场大规模的“叛乱”正在上演。

一个约3米高的庞大金属箱正通过消失在屋顶上的橙色粗电缆，静悄悄地发射兆兆字节的数据。这是全球最先进的冷冻电子显微镜之一：一台利用电子束为冷冻的生物分子成像并揭秘其分子形状的设备。英国医学研究委员会分子生物学实验室（LMB）结构生物学家Sjors Scheres像个矮子一样站在这台价值500万英镑（合770万美元）的设备旁边介绍说，这台显微镜非常敏感，以至于一个叫喊声就能毁掉试验。

在全球实验室中，类似这样的冷冻电镜正影响着结构生物学领域。过去3年里，它们揭示了制造蛋白的核糖体细节，而这些发现正在以飞快的速度发表于顶级期刊。结构生物学家们毫不夸张地认为，他们的领域正处于一场革命当中：冷冻电镜能快速创建那些抗拒X射线结晶学和其他方法的分子的高分辨率模型。与此同时，利用此前技术获得诺贝尔奖的实验室正争先恐后地学习这种“新贵”方法。

挑战“王者”

当1973年生物学家Richard Henderson到LMB研究一种被称为菌视紫红质的蛋白时，利用光能量推动质子穿过细胞膜的X射线结晶学是毫无疑问的“王者”。Henderson和他的同事Nigel Unwin利用这种蛋白制成二维晶体，但它们并不适合X射线衍射。因此，两人决定尝试电子显微镜。

当时，电子显微镜用于研究被重金属染色剂处理过的病毒或组织切片。一束电子被射向样品，其中挣脱开来的电子被探测到并用于描绘它们所撞入的材料结构。这种方法产生了烟草病菌的首幅清晰图像，但染色剂使观察单个蛋白变得困难，更不用说X射线所能揭示的原子水平上的细节。

在一个关键步骤中，当Henderson和 Unwin利用电子显微镜对菌视紫红质的晶片进行成像时，他们省略了染色剂，相反把晶体放在金属网格上，以便使蛋白凸显出来。“你能看到蛋白中的原子。”和Unwin在1975年发表了菌视紫红质结构的Henderson介绍说。“这是一个巨大的进步。”美国加州大学旧金山分校细胞生物学家David Agard表示，“这就是说，利用电子显微镜研究蛋白结构将成为可能。”

冷冻电镜领域在上世纪八九十年代得到发展。一个关键进步是将液态乙烷用于瞬间冻结溶液中的蛋白并使其保持静止。不过，通常情况下，这种技术仍然只能将蛋白结构解析到10埃（1埃相当于1纳米的十分之一）的分辨率——与X射线晶体学超过4埃的模型相比并没有竞争力，并且远远无法满足将这些结构用于药物设计的要求。当诸如美国国立卫生研究院等资助者把上亿美元投资到野心勃勃的晶体学项目时，对冷冻电镜的资助远远落后于此。

1997年，当Henderson参加关于3D电子显微镜的年度高登研究会议时，一位同事在开幕式上发表了颇有挑衅意味的声明：冷冻电镜是一种“小生境”方法，不可能取代X射线晶体学。不过，Henderson能看到一个不同的未来，并且在随后的演讲中进行了反驳。“当时我说，我们应当让冷冻电镜在全球统治所有结构学方法。”他回忆道。

革命从此开始

此后第二年，Henderson、Agard和其他冷冻电镜的狂热支持者有条不紊地实现了各种技术改善，尤其是找到了感知电子的更好方法。在数码相机风靡世界很久之后，很多电子显微镜专家仍然偏好过时的胶片，因为它能比数字传感器更高效地记录电子。不过，和显微镜生产厂商一道，研究人员开发出远超胶片和数码相机探测器的新一代直接电子探测器。

这些从2012年左右获得应用的探测器，能以每秒几十帧的速率捕捉单一分子的速射图像。与此同时，诸如Scheres等研究人员编写了复杂的软件程序，将上千幅2D图像转变成在很多情况下可与晶体学解析的分子图像质量相媲美的3D模型。

冷冻电镜适合能忍受电子轰击而不会四处晃动的稳定、大型分子，因此通常由几十个蛋白制成的分子机器是很好的目标。而研究证明，没有什么比由RNA相互缠绕支撑的核糖体更加合适了。通过X射线晶体学解析核糖体结构的方法，让3位化学家获得了2009年诺贝尔化学奖。过去几年里，不同的研究团队迅速发表了来自众多生物体的核糖体冷冻电镜结构，包括首个人类核糖体高分辨率模型。在由分享了2009年诺贝尔奖的Venki Ramakrishnan领导的LMB实验室，X射线晶体学在很大程度上变得无人问津。他认为，对于大型分子来说，“冷冻电镜将大幅取代晶体学技术的预测是可靠的”。

今年5月，加拿大多伦多大学结构生物学家John Rubinstein和他的同事利用约10万幅冷冻电镜图像，创建了一种名为V-ATPase、形状类似转子的酶的“分子影片”。V-ATPase通过燃烧三磷酸腺苷（ATP）推动质子进出细胞液泡。“我们看到的是一切事情都在灵活进行。”Rubinstein说，“它在弯曲、扭动和变形。”在他看来，这种酶的灵活性能帮助其高效传递ATP释放的能量。

统治结构生物学领域

像任何新兴领域一样，冷冻电镜领域也有着成长的烦恼。一些专家担心，竞相利用此项技术的研究人员会产生有问题的结果。2013年发表的一种艾滋病病毒表面蛋白的结构，便受到科学家的质疑。他们认为，用于构建模型的图像是白噪声。从那以后，虽然其他团队产生的X射线和冷冻电镜模型对原始模型提出了挑战，但这些研究人员一直坚守他们的成果。

今年6月，在高登会议上，想要更多质量控制的研究人员通过一项决议，督促各期刊为审稿人提供关于冷冻电镜结构如何被创建的细节资料。

成本也会减缓此项技术的扩散。据Scheres估算，LMB每天花费约3000英镑运行其冷冻电镜设备，还要加上1000英镑的电费。大部分电费是由储存和处理图像所需的计算机产生的。“对于很多实验室来说，这是一项很高的开支。”

为了让冷冻电镜的使用更加便利，一些资助者建立了研究人员能预定时间的共享设备。霍华德·休斯医学研究所（HHMI）在其弗吉尼亚州珍利亚农场校区运营着一个对HHMI资助的研究人员开放的冷冻电镜实验室。在英国，由政府和惠康基金会资助的一台全国性冷冻电镜设备，今年在牛津附近的迪德科特开始运行。“人们想要了解冷冻电镜，已成为当下的一股浪潮。”帮助建立上述设备的伦敦大学伯克贝克学院结构生物学家Helen Saibil表示。

追赶这一浪潮的还有纽约洛克菲勒大学生物物理学家Rod MacKinnon。他因确定了特定离子通道的晶体结构而共同分享了2003年诺贝尔化学奖，但如今却在深入研究冷冻电镜。“我正处在学习曲线的陡坡上，而这总是令我兴奋不已。”MacKinnon希望利用冷冻电镜研究离子通道是如何打开和关闭的。

当Henderson在1997年反驳说冷冻电镜将统治结构生物学世界时，他或许是在口是心非。但将近20年以后，他的预言已不像当时看上去的那么夸张。“如果继续发展下去，并且所有技术问题都得到解决，冷冻电镜确实会成为一种占据统治地位的技术，而不仅仅是第一选择。”Henderson说，“我们或许已经成功了一半。”（宗华）