导读
在超分辨荧光显微镜领域，实现具备纳米级分辨率的长期稳定成像一直是技术发展的关键瓶颈。热机械漂移、样本位移等问题往往限制了单分子定位技术的精度与应用范围。近日，来自阿根廷、德国、波兰与瑞士的国际合作研究团队展示了一套开源的稳定系统，为超分辨显微镜实现亚纳米尺度下的长期、高精度的三维稳定性提供了解决方案。
研究团队将近红外光束漂移跟踪、金纳米颗粒标记与实时反馈控制相结合，通过单相机同步获取横向与轴向漂移信号，实现了三维亚纳米级（<1 nm）的样本位置稳定，并成功保持了数小时。该系统适用于多种超分辨技术，并成功在DNA折纸结构中解析了10 nm间距的分子位置，为纳米级成像与单分子跟踪提供了开源、模块化、易集成的硬件与软件平台。
该研究成果近日发表于国际顶级学术期刊《Light: Science & Applications》，题为“Open-source Sub-Nanometer Stabilization System for Super-resolution Fluorescence Microscopy”。阿根廷国家科学技术研究委员会的Florencia Edorna与Florencia D. Choque为共同第一作者，Lucía F. Lopez与Andrés Zelcer为共同通讯作者。
研究背景
随着荧光显微技术（Fluorescence Microscopy）的发展，现有的荧光显微镜分辨率已突破至1–10 nm尺度，使得在复杂生物环境中直接观察单个分子成为可能。然而，实现这一精度要求能够对样本漂移进行严格控制。MINFLUX（minimal photon fluxes，最低光子通量显微技术）、RASTMIN（raster scanning for minimal emission fluxes, 用于最小发射光通量的光栅扫描显微技术）等技术依赖于将样本固定在激发图案中，需要主动校正漂移才能达到其理论上的纳米级分辨率极限。目前，虽然已有多种漂移校正策略，但大多依赖专用硬件、复杂校准或多相机系统，成本高昂且不易集成，限制了其在广大研究实验室中的普及与应用。
此外，现有稳定系统往往难以同时实现平面方向（XY）与轴向（Z）的亚纳米级长期稳定，尤其是在单分子定位实验中，光漂白与闪烁现象使得基于荧光信号的自稳定方法不可靠。因此，开发一种开源、模块化、适用于多种显微平台的三维亚纳米稳定系统，成为推动超分辨技术普及与应用的关键需求。
创新研究
研究团队创新性地设计了一套开源的三维亚纳米稳定系统，可作为独立模块集成到任意荧光显微镜中（见图1）。系统使用近红外激光，通过单个相机同时捕捉金纳米颗粒的散射信号（用于XY方向稳定）与全内反射焦点反射信号（用于Z方向稳定）。该设计既避免了多相机系统的复杂性与成本，又实现了三维漂移的同步跟踪与校正。
研究团队进一步开发了开源控制软件“Takyaq”，提供图形用户界面（GUI），支持多种相机与压电平台，与系统硬件无关且易于定制。软件采用实时图像采集、定位与反馈控制循环，可在约50 ms周期内完成三维位置校正。在RASTMIN系统中，团队提出的稳定系统在130分钟内实现了平均漂移标准差σx=0.77 nm、σy=0.84 nm、σz=0.76 nm的三维亚纳米稳定效果（见图2）。
在应用验证中，研究团队在RASTMIN与p-MINFLUX两种系统中测试了该稳定系统的性能。在RASTMIN实验中，系统使单分子定位精度接近理论Cramér-Rao极限；而在p-MINFLUX实验中，系统成功解析了DNA折纸结构中两个相距10 nm的结合位点，并实现了长达8分钟的分子动态跟踪（见图3）。
图1：(A) 稳定系统的光路示意图。分束器（BS1）将近红外光分成两路。在轴向（Z）对焦光路（虚线边框所示光束）中，透镜（L1）与显微镜的管镜（TL）构成一个4f系统。对于平面方向（XY）稳定，由L2和L3组成的扩束望远镜将光束扩展，并经由TL聚焦于物镜的后焦面（BFP），两条激发光路通过BS2合束，BS3用于分离激发光和相机探测信号。在探测光路中，物镜与TL组成的系统在BS3与L4之间形成一个中间像。由TL和L4构成的4f系统在后焦面像面处设置了一个光阑，以阻挡准直后以大角度入射、并因L4离轴聚焦的反射激发光。光阑之后，另一中继透镜L5将金纳米颗粒的像成在相机上。(B) 基于全内反射的焦点稳定方法示意图。焦点位移Δz 转化为图像中焦点信号的横向位移Δr。(C) 金纳米颗粒散射信号与焦点反射信号图像（红框标示）。单个金纳米颗粒（白框标示）的细节及其一维强度分布（点）的高斯拟合曲线（红线），拟合标准差σ= 184 nm。
图2：稳定系统软件。（A）稳定软件的主要处理流程框图。（B）图形用户界面的主窗口截图。上方面板显示焦点光束（红色方框）与选定的基准标记感兴趣区域（白色方框）的实时图像；下方面板显示各方向（XY位移用青色线条，Z位移用红色线条）及平均位移（红色线条）随时间变化的曲线图。
图3：利用稳定系统在RASTMIN中实现的定位精度及p-MINFLUX对动态DNA折纸结构的成像。（A）RASTMIN的激发光束模式示意图。（B）RASTMIN在开启与未开启主动稳定状态下对单分子定位性能的比较。样品为带有固定单个ATTO 647N荧光团的DNA折纸结构，测量时间为150秒（每个时间仓长度为216毫秒，平均光子数=1000）。未开启稳定系统时，因样品漂移导致荧光团移出激发光束模式，有效采集时间仅约40秒。（C）对单个ATTO 647N分子进行不同光子数N的RASTMIN测量所得的定位精度。每个N值下进行了四次独立测量，各获得100次定位结果。图中同时给出用于比较的理论精度下限（实线）及考虑稳定系统贡献的预期总精度（灰色阴影区域）。（D）p-MINFLUX的激发光束模式示意图。（E）动态DNA折纸“钟形”结构示意图，该结构包含单个ATTO 643荧光团及两个间距10 nm的结合位点。（F）使用p-MINFLUX沿DNA折纸主轴获得的450秒定位轨迹（每个时间仓长度=100毫秒）及其50秒细节放大图。（G）p-MINFLUX在开启与未开启主动稳定状态下的性能比较。样品：动态DNA折纸“钟形”结构，其中单个ATTO 643荧光团在两个相距10 nm的位置间切换。测量时间：112秒（时间分箱70毫秒，平均光子数=1800）。
总结展望
本研究提出并验证了一种开源、模块化的三维亚纳米级稳定系统，适用于MINFLUX、RASTMIN等超分辨显微技术。这一稳定系统兼具简洁经济的光路设计、模块化特性及用户友好的开源软件，有望被更多研究团队应用于多种超分辨显微技术中，使这些强大的科研工具更易于普及，从而有助于材料科学、纳米光子学、化学等领域的研究发展。（来源：LightScienceApplications微信公众号）
相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-025-02022-6
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