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| SEL Research | 新引物可显著提高在土壤线虫群落宏条形码的鉴定效果 |
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论文标题：A single degenerated primer significantly improves COX1 barcoding performance in soil nematode community profiling（新引物可显著提高在土壤线虫群落宏条形码的鉴定效果）
期刊：Soil Ecology Letters
作者：Yincai Ren, Dorota L. Porazinska, Quanhui Ma, Shuhan Liu, Hongmei Li, Xue Qing
发表时间：06 sep 2023
DOI：10.1007/s42832-023-0204-4
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本研究设计并测试了线虫线粒体宏条形码引物COIFGED。通过单头虫样本以及对人工模拟线虫群落进行测试，结果表明，新设计的引物COIFGED/JB5GED的能够显著提高鉴定物种的覆盖度与扩增效率，优于四种常用的COX1引物（JB3/JB4.5、JB3/JB5GED、COIF/COIR）；对线虫群落分析表明，该引物优于COX1常用引物JB3/JB4.5，但注释出的种类不及传统18S，这主要是因为数据库中相关参考序列缺失。通过COX1数据库的构建与注释技术提升，该基因在近缘种群宏条形码鉴定上具有一定潜力。
图1：线粒体引物COIFGED/JB5GED单头虫扩增效率测试
图2：不同宏条形码引物扩增子测序稀疏曲线（A）与注释物种多样性比较（B）
线虫在土壤生态系统中发挥着重要作用，同时也是土壤健康的重要指示物。由于土壤线虫个体小，种类繁多，且缺乏直观的鉴定特征，线虫的鉴定耗时耗力，实践操作中极为困难。传统的形态学鉴定专业性强，随着全球线虫分类学研究者数量的急速下降，线虫鉴定已成为土壤生态学相关研究的重要制约因素之一。DNA条形码技术不依赖形态学特征，具有操作简单、稳定性好的特点，已被广泛应用于多种生物种类的鉴定中。DNA条形码与高通量测序结合形成宏条形码技术（metabarcoding），该技术对混合种群进行DNA提取，通过对核糖体RNA或线粒体基因片段进行扩增子测序，能够一次性获得土壤中大量个体的鉴定信息，具有广阔的前景。现有的DNA条形码与宏条形码技术主要依赖核糖体18S基因，特别是NF1/18Sr2b引物。但该基因较为保守，难以区分近缘物种，实践中容易低估线虫群落的多样性。线粒体COXI基因种间差异大，种类特异性强，是昆虫等多种动物分子鉴定的重要靶标基因。相比其他动物，线虫COXI基因引物结合位点保守性差，导致引物设计困难。目前应用较多的JB3/JB4.5引物仅能扩增极少数类群，且扩增效果不稳定，阻碍了线虫的分子鉴定。
图3：不同宏条形码引物注释准确度测试
图4：不同宏条形码引物获得的属级别注释结果比较
针对线粒体COXI宏条形码技术中引物选择的困难，本研究设计并测试了高兼并引物COIFGED。结果显示，该引物对COIFGED/JB5GED在线虫鉴定数量和PCR产物质量上优于其他四种常用COXI引物（JB3/JB4.5、JB3/JB5GED、COIF/COIR）。在模拟线虫群落分析中，与COXI引物（JB3/JB4.5）和18S引物（NF1/18Sr2b）相比，新引物的测序饱和阈值及ASV的α多样性更高。模拟线虫群落中25个属，兼并引物的正向和反向分别可鉴定到12和14个属，优于引物JB3/JB4.5，但劣于18S引物（23个属）。进一步研究发现，通过构建系统进化树，该引物可多鉴定7种线虫，使鉴定到的线虫种类更接近18S鉴定结果。这一结果说明，现有GenBank数据库中COXI序列缺乏，造成部分线虫序列无法直接注释鉴定，从而影响了COXI宏条形码的鉴定效率。因此，本研究提出，COXI宏条形码技术在物种检测灵敏度上优于传统18S宏条形码，在近缘种群区分上具有明显优势。未来COXI宏条形码技术应配合相应数据库的建设，才能进一步提升线粒体宏条形码鉴定效率。
作者及团队介绍
任银彩（第一作者），南京农业大学2023级博士研究生，研究方向为土壤线虫群落与微生物互作。
李红梅（共同作者），南京农业大学植物保护学院教授，主要从事植物寄生线虫分类鉴定与生态学研究。
薛清（通讯作者），南京农业大学植物保护学院副教授，主要从事线虫分类鉴定、群体遗传学及线虫群落宏组学相关研究。
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期刊简介
Soil Ecology Letters(SEL)由高等教育出版社与中国科学院城市环境研究所共同主办，SpringerNature海外发行。报道领域包括：土壤生物多样性、土壤互营和食物网、土壤微生物组、土壤—植物相互作用、土壤生物地球化学循环、土壤生物修复和恢复、土壤多功能性、土壤生物对环境变化的响应和适应、土壤生态过程的突破性技术、新理论和模型。栏目包括但不限于：letter to editor, perspective, review, rapid report, research article, commentary, SEL digest。
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