近日，巴黎综合理工学院的Emmanuel Beaurepaire等人开发了一种新型的彩色三阶混频（TSFG）显微技术，实现了对红细胞及血氧饱和度的无标记光学成像，且与三光子显微镜深层组织成像兼容。这项工作为神经科学和生理学中的各种应用开辟了新的道路。
高分辨、原位的定量分析血液动力学和血氧饱和度对于分析正常和病理活动期间的组织代谢非常重要。基于外源荧光探针的双光子显微术是研究红细胞流动和血氧饱和度的相关成像技术，然而其具有以下局限性：一，像素时间在几十毫秒内，难以直接探测到红细胞；二，基于荧光的微循环测量依赖于血液标记，或受较弱的自发荧光干扰；三，受离焦背景信号干扰，成像深度受限。无标记三阶谐波成像技术有望解决这些问题，它是一种多光子成像方式，突出细胞和组织中的界面及光学异质性，在细胞发育和神经科学等领域有广泛应用。
尽管迄今为止三次谐波（THG）对比度主要用于结构成像和作为空间标志，但当频率ω、2ω或3ω与样品中的电子共振相匹配时，三阶非线性极化率χ(3)（3ω; ω, ω, ω）会发生改变，预计可以从这些变化中获得吸收体的某些化学特性，进行功能成像。研究表明，血红蛋白和其他吸收体的三次谐波中存在波长共振。此外，含氧血红蛋白和脱氧血红蛋白具有不同的线性吸收光谱，特别是在415-430 nm范围内的Soret吸收带附近。因此，利用光谱型三次谐波(THG)显微镜有望实现无标记红细胞成像，并报告它们在体内的氧合状态。这需要建立并表征红细胞的三次谐波(THG)信号的波长特性，此外，需要一种高效的与显微镜兼容的光谱成像方案，用于流动红细胞的观测。
在这项工作中，研究人员发展了一种新型无标记三阶谐波（THG）和三阶混频(TSFG)成像技术，用于斑马鱼胚胎中流动红细胞及氧合状态的检测，获得了单细胞分辨率及微秒级像素时间；同时他们将这种技术与三光子显微镜结合，实现了成年活体斑马鱼大脑中红细胞的深层成像（深度超过600 μm）。
图1展示了彩色三阶混频（TSFG）显微技术的成像原理。作者将波长在1045 nm-1300 nm范围的两束飞秒脉冲激光的时空域重叠后，将激励下产生的三次谐波（THG）和三阶混频（TSFG）光信号定向传输到三个独立的探测器上实现同步探测，实现对运动物体(如活体红细胞)的比率成像（图1a）。
实验中，将波长为λ1的激发光束与波长为λ2的参考光束重叠，具有非线性系数χ(3)的介质在波长为λ1/3和λ2/3处分别产生两个三次谐波（THG）信号，在波长为1/(2/λ1+1/λ2)和1/(1/λ1+2/λ2)处分别产生两个三阶混频（TSFG）信号。假设λ1=1045 nm，λ2=1300 nm，这四个信号波长大约为348、373、401和433 nm （图1b），即对应于血红蛋白Soret吸收带附近的不同波长，与血红细胞的Soret吸收带发生强烈共振，导致共振波长的信号增强，且共振波长与红细胞的氧合状态相关，带来成像对比度 (图1c)。
图1 彩色三阶混频（TSFG）显微镜用于血液成像原理图。
作者演示了彩色三阶混频（TSFG）显微技术在几个方面的应用：使用彩色三阶混频(TSFG)显微镜检测活体斑马鱼胚胎中的红细胞（图2）及活体成年斑马鱼脑中的深层组织血液成像（图3）。
实验结果表明，这种技术提供了一种无标记红细胞特异性成像对比度，并对红细胞的氧合状态非常敏感，且具有以下特征：i）深层显微成像（深度超过600 μm）中也能提供单细胞分辨率；（ii）微秒级的像素持续时间；（iii）无标记成像；（iv）直接探测红细胞而不是血浆；（v）由于可以实现多波长同步比率测量，因此可以探测移动的物体（如流动的红细胞）。
此外，这种技术也可扩展到三阶谐波（THG）显微镜中，实现血液与其他可见结构（如骨髓）的分开成像。
图2 使用彩色三阶混频（TSFG）显微镜检测活体斑马鱼胚胎中的红细胞。(a)实验方案。(b)三次谐波（THG）光谱。(c)血管和红细胞彩色三阶混频（TSFG）图像分割。(d)同时获取胚胎中红细胞的三阶混频（TSFG）和荧光图像。(e)整个胚胎的三阶混频（TSFG）图像。
图3 活体成年斑马鱼脑中的深层组织三阶混频（TSFG）显微成像。(a)深层组织三阶混频（TSFG）显微成像设置方案 (b)彩色三阶混频（TSFG）成像计算的XZ切片图，成像深度大于600 μm。(c)端脑和分段血管中的成像体积的三维渲染。
该文章被发表在《Light: Science & Applications》期刊上，题为“Label-free imaging of red blood cells and oxygenation with color third-order sum-frequency generation microscopy”，Júlia Ferrer Ortas为第一作者，Emmanuel Beaurepaire为通讯作者。（来源：LightScienceApplications微信公众号）
相关论文信息：https://www.nature.com/articles/s41377-022-01064-4
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