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| FASE |《农业科学与工程前沿》研究：柑橘砧木枳抗旱基因功能鉴定 |
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论文标题：Overexpression ofPtrLEA7, a late embryogenesis abundant family gene fromPoncirus trifoliata, confers enhanced drought tolerance by enhancing antioxidant capacity (柑橘砧木枳抗旱基因功能鉴定)
期刊：Frontiers of Agricultural Science & Engineering
作者：Tonglu WEI,Dalong GUO,Jihong LIU
发表时间：04 Jan 2021
DOI：10.15302/J-FASE-2020368
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编者荐语：
《前沿》系列之《农业科学与工程前沿》前沿研究
绿色可持续发展之园艺研究
Horticulture Research for Green and Sustainable Development
专 辑 文 章 介 绍
• 第四篇 •
▎论文ID
Overexpression ofPtrLEA7, a late embryogenesis abundant family gene fromPoncirus trifoliata, confers enhanced drought tolerance by enhancing antioxidant capacity
柑橘砧木枳抗旱基因功能鉴定
期 刊：Frontiers of Agricultural Science and Engineering（FASE）
作 者 : Tonglu WEI1,2, Dalong GUO2, Jihong LIU
通讯作者 : Jihong LIU
liujihong@mail.hzau.edu.cn
1. Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (MOE), College of Horticulture and Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China.
2. College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China.
Cite this article :
Tonglu WEI, Dalong GUO, Jihong LIU. OVEREXPRESSION OF PTRLEA7, A LATE
EMBRYOGENESIS ABUNDANT FAMILY GENE FROM PONCIRUS TRIFOLIATA, CONFERS ENHANCED DROUGHT TOLERANCE BY ENHANCING ANTIOXIDANT CAPACITY. Front. Agr. Sci. Eng., 2021, 8(2): 236–246https://doi.org/10.15302/J-FASE-2020368
• 文 章 摘 要 •
胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）基因编码一类高亲水性蛋白，广泛参与非生物胁迫应答进程。然而，目前大多数高等植物的LEA基因尚未被鉴定。本研究从枳中分离了LEA家族基因(PtrLEA7)，并对其抗旱功能进行了研究。PtrLEA7全长420 bp，编码139个氨基酸。系统发育分析表明PtrLEA7 蛋白属于 LEA_4 亚家族。qPCR表达分析发现PtrLEA7的表达受到脱水、低温和ABA处理的强烈诱导以及盐胁迫的轻微诱导。亚细胞定位结果显示PtrLEA7 蛋白同时位于细胞质和细胞核内。为研究PtrLEA7基因的功能，分别获得了烟草和枳PtrLEA7超表达转基因植株。胁迫耐受性试验结果显示，与野生型相比，超表达系的脱水耐受性和抗旱性显著增强，表明PtrLEA7正调控植株的抗旱性。此外，转基因植株CAT、SOD和POD三种抗氧化酶基因的表达量及过氧化氢酶活性均较野生型显著增加，活性氧积累减少。这些结果表明PtrLEA7增强抗旱性一定程度上是通过提高抗氧化能力来实现的。
关键词:生物胁迫，抗氧化剂，干旱，胚胎发育晚期丰富蛋白，枳
• 文 章 亮 点 •
1. 从枳中克隆了一个胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）家族基因PtrLEA7。
2.PtrLEA7的表达受到胁迫和ABA的强烈诱导。
3.PtrLEA7对耐旱性有正向调节作用。
4.PtrLEA7的超量表达提高了抗氧化能力。
▎Graphical abstract
▎研究背景
干旱胁迫会使植物失水萎蔫，严重影响其正常生长和发育，长期干旱会直接导致植物死亡，提高植物的抗旱性意义重大。发掘重要的抗逆基因是分子育种的基础，研究干旱响应基因并鉴定其在植物抗旱性中的作用具有重要的生物学意义。枳是柑橘中最重要的砧木品种，抗寒性和抗病性强，但抗旱性相对较弱，从枳中发掘重要的抗旱基因，研究其抗旱机制具有重要的意义。在前期研究中，我们对枳干旱处理前后的转录组进行了测序分析，筛选到了一些干旱响应基因。从这些基因中，我们发现一个LEA（late embryogenesis abundant）家族基因极显著的受到干旱胁迫诱导。因此，为进一步深入研究该基因在干旱胁迫响应中的功能，我们开展了本研究。
▎主要研究结果1.PtrLEA7能够被多种胁迫诱导
实时荧光定量结果表明，PtrLEA7能够被脱水、低温和盐胁迫诱导，且能够被ABA处理诱导，表明PtrLEA7可能在多种非生物胁迫中发挥重要功能。
Fig.1PtrLEA7在不同处理下的表达分析
2.PtrLEA7正调控抗旱性
为进一步研究该基因在干旱胁迫中的功能，我们将该基因分别在烟草和枳中超表达，成功获得了超表达转基因烟草和枳。通过干旱或脱水处理，结果显示超表达植株的抗旱性均显著高于野生型植株，表明超表达PtrLEA7可提高植物的抗旱性，PtrLEA7正调控抗旱性。
Fig.2 超表达PtrLEA7可提高烟草的抗旱性
Fig.3 超表达PtrLEA7可提高枳的抗脱水能力
3.PtrLEA7超表达枳抗氧化能力提高
三个抗氧化酶基因（CAT, SOD, POD）在超表达枳中的表达量显著高于野生型，同时，CAT（过氧化氢酶）在超表达枳中的活性也显著高于野生型。通过DAB和NBT染色，结果显示脱水处理后超表达枳叶片中积累的活性氧显著低于野生型。该结果表明超表达PtrLEA7可提高枳的抗氧化能力。
Fig.4PtrLEA7过表达转基因枳植株的抗氧化能力和ROS积累分析
▎结论
本研究从枳中克隆得到一个LEA家族基因（命名为PtrLEA7），该基因定位于细胞膜和细胞核中。PtrLEA7表达量受多种胁迫诱导，包括脱水、低温和盐胁迫。通过将该基因在烟草和枳中分别超表达，结果表明超表达PtrLEA7可提高抗旱性。进一步研究表明，超表达PtrLEA7抗旱性增强与其抗氧化能力的提升有关。
摘要
Late embryogenesis abundant (LEA) genes encode highly hydrophilic proteins that are essential in abiotic stress responses. However, most LEA genes in higher plants have not yet been investigated. This study identified an LEA family gene (PtrLEA7) from Poncirus trifoliata and studied its function in drought tolerance. The full-length coding sequence ofPtrLEA7was 420 bp encoding a protein of 139 amino acids. Phylogenetic analysis shows that PtrLEA7 protein belongs to the LEA_4 subfamily. Expression profiling by qPCR found thatPtrLEA7was strongly induced by dehydration, cold and ABA treatments, and slightly induced by salt stress. Subcellular localization reveals that PtrLEA7 protein was located in both cytoplasm and nucleus. To investigate its function, transgenic plants of both tobacco andPoncirus trifoliataoverexpressingPtrLEA7were obtained. Stress tolerance assays show that overexpression lines had enhanced dehydration and drought tolerance compared with wild type plants, indicating thatPtrLEA7positively regulates drought tolerance. In addition, transgenic plants had much higher expression levels of three antioxidant enzyme genes (CAT,SODandPOD) and significantly increased catalase enzyme activity, accompanied by reduced reactive oxygen species accumulation in comparison with wild type plants. Collectively, this study demonstrates thatPtrLEA7can confer enhanced drought tolerance partially via enhancing antioxidant capacity.
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