导读

单颗粒追踪（Single particle tracking, SPT）是指利用光学显微成像系统描绘出单个颗粒或分子的运行轨迹，它可以提供单颗粒随时空变化的动态行为信息，揭示出被集群平均掩盖的单颗粒活动特点，反映出单颗粒周边微环境的异质性，促进对生命、物理、化学过程的深入研究，因而被广泛应用于生物学、材料学、物理学和生物医学等领域。基于荧光标记物的单颗粒追踪技术，主要优点是低背景强度，可以通过滤波片去除激发光的背景噪声；但其面临着光漂白、光毒性等问题，并且荧光发射强度和持续时间对追踪速度和精度造成了限制。

近些年，干涉散射显微成像（Interference Scattering Microscopy, iSCAT）得到快速发展，这是一种基于光学同轴干涉效应的高灵敏无标记单颗粒检测和追踪技术，可以以高时-空分辨率跟踪单个无标记颗粒，如单个病毒、蛋白质、介质或金属纳米颗粒等。但对于干涉散射显微镜来说，相较于面内X-、Y-方向上的定位，颗粒在轴向Z方向上的定位相对困难，因为随着颗粒和成像物镜焦平面间距的变化，单颗粒光学图像的对比度不断反转，当颗粒成像对比度接近零时，难以实时、精准的对该颗粒进行定位。同时，无论是干涉散射显微镜还是常规光学显微镜，当被测颗粒偏离成像平面时，成像对比度逐渐变差，因此难以实现长轴向距离的单颗粒成像与高精度追踪。

近日，中国科学技术大学物理学院张斗国教授课题组与袁军华/张榕京教授课题组合作，提出并实现了一种新型的单颗粒无标记三维追踪技术。研究团体将一维光子晶体增强的自旋-轨道耦合效应与光学同轴干涉效应同时引入光学显微成像系统，构造出携带单颗粒轴向位置信息的双螺旋点扩散函数（Double-Helix Point Spread Function, DH PSF），进而实现了长轴向距离的单颗粒无标记三维（3D）追踪技术。研究成果以“One-dimensional photonic crystal enhancing spin-to-orbital angular momentum conversion for single-particle tracking”为题在线发表在国际知名学术期刊《Light: Science & Applications》。

研究内容

在本工作中，张斗国教授课题组与袁军华/张榕京教授课题组合作，提出将自旋-轨道耦合效应与光学同轴干涉效应同时引入到显微成像系统，改造干涉散射显微镜的点扩散函数；同时设计并制备了由氧化硅和氮化硅材料构成的全介质一维光子晶体，将它作为干涉散射显微镜的样品衬底，可有效增强单颗粒散射光的自旋-轨道角动量耦合转换效率，从而将单颗粒散射光调控成点光源涡旋光（图1a）。该点光源涡旋光与直接透射参考光进行同轴干涉，形成了一种具有双螺旋结构的点扩散函数。由于Gouy相位的存在，当单颗粒沿物镜光轴纵向移动时候，该双螺旋结构发生旋转，其旋转角度与单颗粒的轴向位置关联，从而成功的将单颗粒的轴向位置信息编码到成像系统的点扩散函数中（图1b, c）。

图1. （a）1D PC增强自旋轨道转换示意图；（b,c）不同轴向位置颗粒点扩散函数图像以及定标曲线；（d）20 nm金颗粒溶液中扩散轨迹图；（e）细菌鞭毛运动行为研究示意图；（f）细菌鞭毛上微珠运动三维轨迹图。

研究创新

双螺旋点扩散函数的突出优点是：在长轴向距离（约 4倍成像物镜焦深）内，保持较高的图像对比度，有利于单颗粒的长距离连续追踪；其固有的同轴干涉性质，使其具有干涉散射显微镜的高灵敏度、高时间分辨率等特点；单颗粒的轴向位置可以直接从双螺旋结构的取向角度读取，与颗粒的尺寸、图像对比度解耦；而传统干涉散射显微镜，需要从单颗粒显微图像的对比度、圆环直径大小信息，拟合推导出单颗粒的轴向位置。但在实际应用中，在未知颗粒先验信息的情况下，单颗粒显微图像的最大对比度未知，且该对比度又随颗粒轴向位置变化而周期振荡，因此显著增加了单颗粒轴向定位的难度和复杂度。

利用这种具有高对比度双螺旋点扩散函数的干涉散射显微成像系统，该研究团队实时记录直径20 nm金纳米颗粒在甘油溶液中的三维扩散轨迹（图1d），得到了纳米颗粒的扩散系数和流体动力学半径，展示了该技术跟踪单个纳米尺寸颗粒的能力。其纵向定位距离范围约2微米，优于现有报道的几百纳米的实验记录。

应用展示

在生物学应用上，研究团队将该系统应用到细菌鞭毛马达的动力学行为研究。在细菌鞭毛马达的研究中，通常会将单个颗粒附着到缩短的鞭毛丝末端（图1e）；鞭毛的运动特性，使得该颗粒能以大约100 nm的半径沿着大致圆形的轨迹旋转。由于连接马达和鞭毛丝的鞭毛钩具有弹性，该颗粒通常不会只在一个成像平面内旋转。但典型的3D追踪方法（如离焦或全息成像）在轴向分辨率方面的限制，之前未能对该单个颗粒的旋转进行3D追踪，只记录了鞭毛上单颗粒运动轨迹的2D投影，并通过假设圆形轨迹，将2D椭圆投影回圆形来重建相应的3D轨迹。在这个重建过程中，空间分辨率变差，导致马达动力学的重要细节丢失。

在这里，研究团队采用单颗粒无标记三维追踪系统，以2000帧每秒的速度记录了单颗粒旋转的3D轨迹（图1f）。由于采用的是无标记成像方式，时间分辨率比使用荧光的方法高得多，因此，测得3D轨迹一周所需的时间大约为19毫秒。实验结果清楚地验证了微球确实以约110纳米的半径在3D空间中旋转。

总结与展望

本研究通过采用一维光子晶体增强了自旋-轨道角动量转换效应，显著提升了干涉散射显微镜的成像对比度和轴向跟踪范围。在过去的三十年里，自旋和轨道角动量转换一直是光学领域的重要研究课题，本研究首次将这些概念引入干涉散射成像技术并增强其性能，使其对相关研究人员更具吸引力。展望未来，进一步结合干涉散射成像与点扩散函数工程技术，以及一些先进的数据/图像后处理方法，提出的单颗粒无标记三维追踪技术将变得更为强大，为生物、化学和物理科学中等应用开辟新的机会。

中国科学技术大学物理学院博士生黄明川、陈钱坤为本论文共同第一作者，张斗国与袁军华教授为本论文共同通讯作者。其他的合作者包括中国科大物理学院刘洋博士，张弛博士，张榕京教授。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委项目经费的支持。相关样品制作工艺得到了中国科学技术大学微纳研究与制造中心的仪器支持与技术支撑。（来源：LightScienceApplications微信公众号）

相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41377-024-01623-x