论文标题：The Identification of Genetic Determinants of Methanol Tolerance in Yeast Suggests Differences in Methanol and Ethanol Toxicity Mechanisms and Candidates for Improved Methanol Tolerance Engineering （酵母中甲醇和乙醇毒性机制的差异以及改进甲醇耐受性工程的候选菌）

期刊：Journal of Fungi

作者：Marta N. Mota, Luís C. Martins, Isabel Sá-Correia

发表时间：27 January 2021

DOI：10.3390/jof7020090

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期刊链接：https://www.mdpi.com/journal/jof

01研究背景

甲醇是一种成本较低且有研究前景的原料，可基于酵母的代谢活性进行生物精炼。但是甲醇毒性会限制这些生物精炼的产量。鉴定与甲醇最大耐受性有关的基因对获得更优良的甲基营养酵母菌株很重要。Journal of Fungi期刊上发表的文章"The Identification of Genetic Determinants of Methanol Tolerance in Yeast Suggests Differences in Methanol and Ethanol Toxicity Mechanisms and Candidates for Improved Methanol Tolerance Engineering" 的研究重点是酵母中甲醇和乙醇毒性机制的差异和改进甲醇耐受性工程的候选菌。

甲醇和甲醛毒性主要细胞靶标分别是膜结构和蛋白质，对甲醇的反应与酵母菌株、线粒体和过氧化物酶体代谢等有关。本文对酵母缺失突变体进行了集体筛选，发现DNA修复机制是甲醛耐受性的基础，Haa1转录因子和Haa1调节子参与了甲酸的耐受性的过程。研究发现亲脂剂乙醇会影响质膜脂质组织，破坏膜生物功能。而质膜脂质中甾醇和不饱和脂肪酸成分的改变有助于酵母抵消这些影响。

研究发现，过氧化物酶体功能也是酵母耐受乙醇和磷脂生物合成的原因，过氧化物酶体功能异常的细胞无法调节膜磷脂的组成，且会影响克服乙醇应激的膜重塑。作者认为，全基因组方法可以识别酵母对亚致死浓度毒物的毒理学反应中涉及的基因和途径，能帮助学者对该反应中涉及的分子机制和信号途径有更深入的理解。

02材料和方法

试验所用材料为单倍体亲本菌株S. cerevisiae BY4741 (MATa、his31、leu20、met150、ura30) 和从Euroscarf获得的衍生单一缺失突变体。

为比较甲醇和乙醇毒性和耐受性的潜在机制，作者分别在含有8% (v/v) 甲醇和5.5% (v/v) 乙醇中的YPD培养基中，筛选Euroscarf单倍体缺失突变体中的易感表型进行化学基因组学分析。为鉴定乙醇耐受性遗传决定因素，作者分别在乙醇浓度为7% (v/v)、10% (v/v)、11% (v/v) 的丰富培养基以及含有8% (v/v) 乙醇的基本培养基进行全基因组研究。

03研究结论

3.1在全基因组范围内鉴定甲醇和乙醇耐受所需的基因

为了与亲本菌株相比较，作者测试了大约5100个缺失突变体对8% (v/v) 甲醇的敏感性，并将生成的数据与在5.5% (v/v) 的乙醇条件下的数据进行比较。结果发现其中402个突变体比亲本菌株对甲醇更敏感，没有检测到基因敲除时提高甲醇耐受性的基因。乙醇耐受性所需基因的完整列表包括445个基因，研究结果表明其中110个基因在测试的实验条件下敲除基因后会导致酵母停止生长。

3.1.1 参与DNA修复和有丝分裂细胞周期的基因

化学基因组学分析结果显示，与DNA修复相关的几个基因在甲醇数据集中富集，但在乙醇数据集中没有，这表明DNA是甲醇毒性的主要特定分子靶标。

3.1.2 参与自噬的基因

参与自噬的16个基因与酵母对甲醇的耐受性有关，自噬基因AIM26、ATG11、RAS2、VAM7、VPS36和YPT6的基因敲除后会产生甲醇敏感性表型，这表明甲醇可能在对细胞内蛋白质和细胞器产生有害影响后，会将细胞质内容物和细胞器再自噬体中进行降解，这个过程是保护反应的其中一部分。

3.1.3 参与储备多糖、细胞壁和膜生物合成的基因

由于在多糖代谢和脂肪酸生物合成中的功能有重要作用，与细胞壁和膜生物合成有关的基因与酵母对甲醇的耐受性相关。研究表明关于多糖代谢，FKS1、GPH1、ROT2、SMI1和TPS2基因的缺失会产生易感表型。参与甲醇和乙醇耐受性相关的膜合成的基因包括麦角甾醇生物合成基因 (ERG2和ERG3)、磷脂生物合成基因 (KCS1、LIP5、PDX3) 和鞘脂生物合成基因 (ELO2、ELO3和SAC1)。

3.1.4 参与蛋白质合成的基因

研究发现通过细胞质和线粒体翻译参与蛋白质合成的甲醇耐受性决定因素包括大量编码 (i) 核糖体大亚基的蛋白质的基因——大亚基的核糖体蛋白、RPL基因；(ii) 核糖体小亚基的蛋白质、小亚基的核糖体蛋白质、RPS基因。

线粒体大亚基蛋白主要由大亚基的线粒体核糖体蛋白家族、MRPL基因编码，而线粒体小亚基蛋白由需要线粒体核糖体小亚基 (MRPS) 和线粒体核糖体小亚基 (RSM) 基因家族来克服甲醇引起的压力。经过细胞质翻译和线粒体蛋白翻译后，作者发现GTF1、IFM1、MRF1、MRP7、MRPS12、MRPL20、MRPL22、MRPL24、MRPL7、MSE1、RSM23和SLM5能赋予对甲醇和乙醇的耐受性。其他与细胞质和线粒体翻译相关的几个基因也能赋予对甲醇和乙醇的耐受性。

3.1.5 参与液泡功能和内体运输的基因

ATP输出和腔内囊泡形成是在共享12个具有液泡和内体功能基因。研究表明酵母细胞暴露于甲醇应激会影响几种运输途径，例如液泡运输和囊泡运输。研究发现与液泡功能相关的甲醇耐受性决定因素包括液泡膜H+-ATPase (VMA) 基因 (参与细胞内pH稳态，液泡形态发生基因) 和液泡蛋白分选 (VPS) 基因。

3.2 转录控制和耐受网络调节

甲醇数据集中富集的生物学功能“染色质重塑”和“沉默”包含12个转录因子 (TF)。其中五个基因与乙醇数据集共享。作者认为TFs Cbf1、Sfp1、Rpn4、Ixr1、Opi1、Sfl1、Sok2、Stb5和Ume6在酿酒酵母的甲醇耐受性中具有重要且更具体的作用，且TFs Cbf1、Sfl1、Sfp1、Rpn4和Ume6也是乙醇耐受性的相关决定因素。

有研究人员认为氧化应激是酿酒酵母中甲醇诱导应激的主要后果，但是本文在所获得的数据集中，一般应激反应Msn2和Msn4以及氧化应激反应Yap1中缺乏众所周知的转录调节因子 (TR)。在10-14% (v/v) 范围内的甲醇浓度下，Yap1表现出明显的甲醇敏感性表型 (图1)，这个证据证实了Yap1对甲醇耐受性的重要性。

图1. 亲本菌株S. cerevisiae BY4741和衍生的缺失突变体yap1、msn4和msn2对甲醇的敏感性。

这项研究确定了约400个甲醇耐受决定因素，其中81个显示出明显的表型。识别出的耐受基因的聚类表明甲醇数据集中的功能类别在乙醇数据集中没有富集，例如染色质重塑、DNA修复和脂肪酸生物合成。几个参与DNA修复的基因 (八个RAD基因) 被确定为对甲醇毒性具有特异性，之前有研究表明了甲醛的耐受决定因素，认为甲醛是一种甲醇解毒途径中间体。

尽管本文确定了对这两种醇的耐受性的大量遗传决定因素的相似性，但作者认为DNA修复和膜重塑是对抗甲醇毒性的更具体的反应之一。作者对赋予酿酒酵母甲醇耐受性的基因进行全基因组搜索的结果可用于酵母的合理遗传操作，以获得能够应对压力甲醇浓度的更强大的菌株，特别是甲基营养酵母。该研究提供了克服甲醇毒性的基因和潜在调控网络相关最新且有价值的信息。这些内容是提高酵母对甲醇耐受性的重要研究起点，研究表明酵母能够分解代谢和复制存在于有前途的生物经济原料 (包括工业残留物) 中的甲醇浓度。

期刊介绍

主编：

David S. Perlin, Hackensack Meridian Health Center for Discovery and Innovation, USA

期刊主题涵盖了病原真菌、医学真菌学、药用真菌、抗真菌药物耐药性、真菌与健康、真菌与皮炎、寄生真菌、真菌分子系统发育、植物真菌和土壤真菌、真菌毒理学、真菌遗传学和进化、真菌生物学、多样性和生态学、真菌和环境互作和真菌应用技术等。目前期刊已被Scopus、SCIE (Web of Science)、PubMed、PMC、CAPlus/SciFinder等数据库收录。