论文标题：Microbial Antigen-Presenting Extracellular Vesicles Derived from Genetically Modified Tumor Cells Promote Antitumor Activity of Dendritic Cells （来自基因修饰肿瘤细胞的微生物抗原提呈胞外囊泡可促进树突状细胞的抗肿瘤活性）

期刊：Pharmaceutics

作者： Tomoko Ito, Kikuya Sugiura, Aya Hasegawa, Wakana Ouchi, Takayuki Yoshimoto, Izuru Mizoguchi, Toshio Inaba, Katsuyuki Hamada, Masazumi Eriguchi and Yoshiyuki Koyama.

发表时间：4 January 2021

DOI：pharmaceutics13010057

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期刊链接：https://www.mdpi.com/journal/pharmaceutics

来源于肿瘤细胞的细胞外囊泡 (EVs) 携带一系列肿瘤相关抗原 (TAA)，是肿瘤疫苗中将抗原转移到抗原呈递细胞 (APC) 的理想候选者。然而，该细胞外囊泡对已经存在的肿瘤细胞并没有显著的治疗作用，这可能与肿瘤细胞的抗免疫功能或抗原的低免疫性有关。

图片来源：Pixabay

为了进一步提高EVs的免疫功能，来自日本大阪府大学的Yoshiyuki Koyam博士及其团队展开了相关研究。他们采用编码ESAT-6 (6 kDa早期分泌抗原靶点) 的质粒对结核分枝杆菌的母细胞进行基因修饰，制备了表达高免疫源性细菌抗原的细胞外囊泡。作者先前的研究分离出了具有ESAT-6抗原表位的分泌型EVs (ESAT-EV)，表现出显著的肿瘤生长抑制作用。本文则通过分析共刺激分子在EV-刺激的树突状细胞 (DCs) 中的呈现来评价人工提呈新表位的EVs对树突状细胞的激活能力，并在同基因小鼠模型中研究了EVs刺激的DCs的抗肿瘤作用。

实验步骤和内容

作者通过含有ESAT-6基因的质粒DNA转染B16细胞，获得具有表达免疫刺激抗原ESAT-6的EVs (ESAT-EV)，对转染条件进行了分析。结果显示三元转染系统能显著提高ESAT-6表位诱导效率，产生可诱导外源性ESAT-6蛋白，使得EVs的分泌具有较高表位，能够产生更高的蛋白表达水平。

基因修饰肿瘤细胞分泌的EV颗粒上ESAT-6表位的数目。

由pDNA编码复合物转染的绿色荧光蛋白的基因表达效率。

接着，作者研究了EVs刺激DCs的分化及免疫刺激能力。通过DCs中CD86抗体的表达强度来看，ESAT-EV可以显著增强CD86抗体的表达强度，有效激活DCs。ESAT-EV的抗肿瘤免疫激活性能测试表明小鼠的白细胞在接受ESAT-EV注射时，B16细胞周围出现强烈的积聚，表现出明显的免疫反应，而经过Naive EV (无ESAT-6抗原表位的EV) 或牛血清蛋白BSA处理的小鼠白细胞没有产生这种现象。与肿瘤细胞共同培养后，经过ESAT-EV处理的小鼠白细胞与3H-胸腺嘧啶核苷的掺入率比经过Native EV或牛血清蛋白BSA处理的小鼠更高。这表明ESAT-EV具有诱导DCs分化，产生免疫反应的作用。

培养的树突状细胞 (DCs) 经ESAT-EV、Native EV或Native EV和ESAT-6蛋白混合物处理后CD86抗体的表达水平。(a) 左图代表点图，右图是经ESAT-EV (红色) 或Naive EV + ESAT-6蛋白 (蓝色) 处理的CD11c阳性细胞中CD86荧光强度的叠加直方图；(b) CD11c阳性细胞中CD86的平均荧光强度 (n = 3，均值±SD，* p < 0.05); (c) PE-Cy7-CD86荧光强度超过300个的细胞数 (n = 3，均值±SD，* p < 0.05，** p < 0.01)。

经过EV处理的小鼠孵育的B16细胞中白细胞的显微镜图像。

与B16细胞共培养后，EV处理的小鼠白细胞中胸腺嘧啶的掺入速率。

随后，作者在荷瘤小鼠中观察了EVs刺激的DCs的抗肿瘤作用。结果显示，经过ESAT-EV刺激DCs后，小鼠的肿瘤生长受到显著抑制，而经过Native EV刺激DCs的小鼠和经过PBS刺激的对照组小鼠在肿瘤生长方面没有受到明显的抑制。

EVs处理的DCs的抗肿瘤效果。

研究结论

通过该项研究，作者发现ESAT-6 (6 kDa早期分泌抗原靶点) 呈递的细胞外囊泡能够刺激树突状细胞，诱导更多的CD86抗体产生。ESAT-EV (具有ESAT-6抗原表位的分泌型EVs) 对正常小鼠的母体肿瘤细胞产生明显的免疫反应，将其注射到树突状细胞中可显著提高荷瘤小鼠的抗肿瘤活性。他们的研究揭示了来源于肿瘤细胞的微生物抗原呈递的细胞外囊泡能够为树突状细胞有效地提供激活信号，为低免疫应答治疗提供新策略。

期刊简介

Pharmaceutics (ISSN 1999-4923; IF 4.421) 是一个国际型开放获取期刊。期刊主题涵盖了生物制药、药物递送、药物控释、药物制剂、药物靶向、药代动力学、纳米医学、药物遗传学、药物基因组学、药效学等。Pharmaceutics采取单盲同行评审，一审周期约为12.7天，文章从接收到发表只需2.7天。