北京时间2月19日24点，国际学术期刊Nature 在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（原生物化学与细胞生物学研究所）童明汉课题组联合上海交通大学医学院附属新华医院黄旲团队的研究成果，题为“In vitro reconstitution of meiotic DNA double-strand break formation”。该研究基于体外表达和纯化的小鼠SPO11-TOP6BL复合体，首次在体外成功重构了DNA双链断裂(Double-Strand Break, DSB)的形成，为解析减数分裂同源重组机制建立了研究平台。

减数分裂是存在于有性生殖生物中的特殊细胞分裂方式，为有性生殖的基础。同源重组是减数分裂中最重要的生物学事件，它不仅使来自亲本双方的遗传物质发生交换，增加了物种遗传的多样性；而且还能让同源染色体之间建立物理连接，以确保它们的精确分离，维持染色体数量的恒定。同源重组起始于程序性DSB的形成。早在1997年，研究发现Spo11为催化酵母减数分裂DSB形成的关键蛋白；并揭示其在切割DNA双链后，会共价结合在DNA的5'末端。然而，如何在体外表达获得有活性的Spo11，以及如何在体外重构减数分裂DSB形成过程，长期以来一直悬而未决，这一问题被誉为减数分裂同源重组研究领域的“圣杯”。

Spo11是一种高度保守的蛋白，属于II B型拓扑异构酶家族中拓扑异构酶VI（Top6）家族。Top6由两个催化亚基（Top6A）和两个调控亚基（Top6B）构成异源四聚体，其活性依赖于Top6A 和Top6B的协同作用。SPO11为 Top6A的同源物；而TOP6BL作为Top6B的哺乳动物同源物，直到2016年才被发现，并被证明也为减数分裂DSB形成所必需。

为了解决体外重构减数分裂DSB形成这一难题，童明汉课题组利用体外蛋白表达纯化系统成功获得了SPO11-TOP6BL复合体，并首次在体外重现其切割DNA双链的活性。之后，与新华医院黄旲团队合作，采用凝胶过滤层析、交联质谱、Pull Down等方法，系统地研究了SPO11-TOP6BL复合体的生化特征；证实该复合体在溶液中主要以异源二聚体形式存在，只有极少部分能形成异源四聚体。接着进一步证明在切割DNA后，SPO11共价结合于切割产物的5’末端。于此，困扰领域近30年的体外重构减数分裂DSB形成难题迎刃而解。

分子细胞卓越中心汤辛哲博士生和合作的胡泽涛博士生为该论文共同第一作者；分子细胞卓越中心童明汉研究员和上海交通大学医学院附属新华医院黄旲教授为该论文共同通讯作者。值得一提的是，美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心Scott Keeney团队、比利时法语鲁汶大学Corentin Claeys Bouuaert团队分别在Nature上发表了背靠背文章“Reconstitution of SPO11-dependent double-strand break formation”和“SPO11 dimers are sufficient to catalyse DNA double-strand breaks in vitro”。Nature同期为三篇文章配发了由加利福尼亚大学圣迭戈分校Francisco Mendez Diaz博士和Kevin D. Corbett教授共同撰写题为“Enzyme used in meiosis makes the cut in vitro”的评述，指出这三项研究代表了减数分裂同源重组领域的"a big break"，开启了该领域的“a new era of research”。该研究工作得到中国科学技术大学蔡刚教授、分子细胞卓越中心吴薇研究员、李典范研究员、刘珈泉研究员、丁建平研究员、张少庆研究员以及李党生研究员的大力支持和帮助；分子细胞卓越中心动物实验技术平台、生物信息学平台、中国科学院上海高等研究院国家蛋白质科学研究（上海）设施为该工作提供了支持。该项研究工作获得国家自然科学基金、科技部、上海市和中国科学院的项目资助。

SPO11-TOP6BL切割DNA后共价连接在DNA的5'端
（a）SPO11-TOP6BL对超螺旋质粒的切割实验，随着反应时间增加，质粒逐渐被切割成线性（b）SPO11-TOP6BL对线性DNA的切割实验，随着反应时间增加，长的线性DNA逐渐被切割成不同长度的DNA片段（c）添加SDS并不能破坏蛋白和DNA的互作,表明SPO11-TOP6BL切割DNA后共价连接在DNA上（d）hTDP2能破坏SPO11和DNA的互作，表明SPO11与DNA的共价连接通过SPO11的Y138残基和DNA的5'端之间形成的5'磷酸酪氨酸键实现

文章链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08551-1