华南理工大学生物科学与工程学院教授熊伟团队与美国国家可再生能源实验室合作，开发出一种基于集群建模与CRISPR干扰（CRISPRi）的新型微生物控制策略。相关成果近日发表于《细胞系统》（Cell Systems）。

“该研究为基因改造微生物的安全管理提供了强有力的解决方案，在合成生物学、生态保护、生物工程安全性提升方面具有重要意义。”研究负责人熊伟表示，研究成果不仅在安全性上超越了传统设计，还具有良好的可拓展性与应用潜力。

基因工程推动了合成生物学、农业、环保领域的快速发展，但也带来了潜在的生态风险——基因改造微生物在实验室外部环境中发生失控扩散，可能对自然生态系统造成不可逆的破坏。依赖性基因回路和“致死开关”系统等传统方法虽然可以在理论上限制微生物生长，但在实际应用中，微生物经常通过基因突变或适应性进化规避机制，形成“逃逸体”。

为了克服此类局限性，熊伟团队提出了一种全新的代谢稳健性调控方法。利用计算建模工具，预测并锁定了微生物核心代谢网络中的关键靶点，这些靶点对代谢网络的稳健性具有显著影响。通过CRISPR干扰技术，研究团队能够在实验中精准调控这些基因的表达，定量控制微生物适应度，抑制微生物的生长。

实验过程中，研究团队首先开发了一个基于“稳健性预测”的计算框架，通过模拟酶活性波动对代谢网络的影响，筛选出对稳健性最敏感的基因靶点，如大肠杆菌核心代谢网络中的磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶等。得益于CRISPRi技术对调控效率的提升，实验中使用了精简版的Cas12m蛋白和经过优化的遗传绝缘体RiboJ，这种组合不仅大幅减少了基因回路的泄漏，还显著增强了多重基因调控的效率与稳定性。

为了确保安全性，研究还关注了多靶点调控，设计了单基因、多基因联合调控策略，证明通过同时靶向多个代谢稳健性关键节点，可以显著降低微生物逃逸的概率。例如，四重基因靶点（ppc、metE、ptsH和cysH）的CRISPRi设计在实验中表现出极强的生长抑制效果，其逃逸频率远低于当前公认的设定标准。

在多种实验室和自然环境模拟条件下，该系统均能保持较高的稳定性和安全性，在葡萄糖、甘油、乙酸等多种碳源条件的验证中始终有效。在经过长达数周的遗传稳定性测试后，仅观察到少量引导RNA突变，没有出现目标基因功能丧失的情况。研究团队还通过LuxR-AHL诱导系统开发了一种“关闭式”CRISPRi回路，在无诱导剂条件下，能够有效终止微生物的增殖，进一步提升了逃逸控制能力。

“除了展示代谢稳健性调控的新方法外，该研究为基因改造微生物的设计和安全使用提供了理论和技术支持。”熊伟表示，未来将进一步优化CRISPRi系统，探索其在非模式微生物和复杂环境中的应用，包括为工业生物领域提供更安全的发酵生产工艺，为农业生物领域提供控制土壤改良微生物繁殖的新路径、限制污染降解微生物扩散以实现环境修复等。

相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.cels.2024.11.012