成功率仅30%，他们建立了全球首个孤独症犬模型

孤独离群、互动困难、对有害声音恐惧、注意力不集中、容易发脾气……孤独症（又叫自闭症）儿童与这个世界的沟通有许多不为人知的挑战。

据世界卫生组织统计，全球大约每100个儿童中就有一人患孤独症。孤独症成因复杂，早期干预能对治疗和改善起到一定作用。但目前尚无明确的医学诊断指标，只能通过观察儿童的社交和对外界刺激的反应来诊断。

现在，中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员张永清团队与合作者用基因编辑技术建立了全球首个孤独症家犬模型，并开发了可实时测量家犬瞳孔变化的眼动测量技术。相关研究近日以“姊妹篇”的形式在线发表于《分子精神病学》杂志。

“这项研究采用最新的基因编辑技术，成功建立了家犬孤独症突变模型，并用一系列行为学、生理学研究验证了模型的可靠性，研究成果转化的潜力非常大，有助于破解孤独症方面的难题。”中国科学院院士、香港大学医学院讲座教授苏国辉评价说。

胚胎上的“小手术”

8年前，张永清作出了科研生涯中的一个重大决定：放弃研究十余年的模式动物果蝇，用家犬建立孤独症模型。

这样的选择经过了一番深思熟虑。与果蝇一样，实验鼠模型具有繁殖能力强、速度快等优势，但其脑结构与人类差异较大，无法与人类建立有效的互动，很难回答与情感相关的神经机制或精神疾病的致病机理等方面的问题。

灵长类是最理想的模式动物。过去几年，张永清团队与暨南大学教授李晓江团队合作建立了孤独症的非人灵长类模型。但其成本高、繁殖慢，应用潜力和规模受限。

经过3万多年的驯化和选育的家犬，是与人类最亲近的伴侣动物。“它们的智力相当于3~5岁的儿童，有着高度发达的情感认知功能，善于与人进行有效的交流。而且家犬繁殖周期短，8到12个月性成熟，两年可以生三胎，一窝可以生4到8只，可在短时间内繁育足量突变体动物。”张永清对《中国科学报》说。

孤独症病因学非常复杂，遗传疾病约占65%，其中仅10%是单基因突变。如何为治疗这一疾病提供分子靶标？

张永清与中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员赖学良、北京希诺谷生物科技有限公司等合作，聚焦孤独症最常见的突变基因Shank3，利用基因编辑技术，创建了国际首例孤独症家犬模型。

这并不容易。曾在猪体内培育出人源中期肾脏的赖学良向《中国科学报》解释，在刚受精的家犬胚胎上用基因编辑技术敲除Shank3，就像在一粒米内部做一场“微型手术”，这使得其成功率仅约30%。同时，基因打靶突变体通常很难存活到性成熟，构建出能够成功繁育出后代从而模拟孤独症在人群间遗传的突变体更是难上加难，只能选择性地敲除部分Shank3基因。

克服重重挑战，合作团队目前已经繁育了四代151个突变家犬模型。

作为一种全新的孤独症动物模型，如何检测这一新范式的可靠性呢？张永清与合作者设计了一系列行为、情感及生物学实验。

首先，研究者通过犬犬互动、人犬互动实验发现，突变犬表现出明显的社交退缩行为，面对困难时向人类求助的主动性也显著降低。

其次，他们通过人工智能深度学习算法对比了普通家犬比突变家犬的摇尾趋势变化发现，突变犬尾巴下垂夹于两股之间，摆动幅度与频率大大降低，表明突变体在社交时处于焦虑与恐惧状态。

“尾巴是家犬表达情感的一个窗户。它们高兴时，尾巴会摇得很快；生气时，尾巴会翘起来；害怕时，会夹着尾巴。”张永清说。此前他与合作者通过人工智能深度学习算法对2万余次狗摇尾巴进行分析发现，与人类的指纹和步态相似，每只家犬都表现出独特而稳定的摇尾特征，当跟人的关系更熟悉时，尾巴会偏向右摇。

为了进一步验证突变体的焦虑表型，研究者还进行了放射性免疫测试，结果发现突变体血清中的应激激素——皮质醇显著增加。皮质醇水平增加以及夹着尾巴或尾巴摇摆减少表明突变体呈现焦虑状态。

“用犬作为精神系统疾病模型，这肯定是首例。”美国耶鲁大学医学遗传学教授姜永辉评价说，犬类模型最大的优点是可用于系统的行为学和生理指标的测定，药物代谢模式也于人的更接近，临床推广潜力相较于小鼠更大，转化的成功率会更高，。

“从果蝇跨界到犬类，我非常佩服张永清研究员的勇气，这非常不容易。他与不同团队建立了很好的协作，作出了十分有价值的工作，他们建立的家犬模型对今后自闭症的研究特别是相关药物筛选有很大的潜力。”中国科学院院士、浙江大学教授段树民评价说。

“丈量”眼睛里的情绪

不只是建立新的家犬模型，张永清和合作者还建立多样化的实验范式来检验新模型。

除了上述实验，他们还把目光投向了新的实验范式——瞳孔大小变化。

众所周知，瞳孔的变化与光线强度变化有关。遇到强光时，人的瞳孔会缩小；在黑暗中，瞳孔则会放大。

实际上，瞳孔的变化还与心智负荷和情绪状态有关。“俗话说，‘见钱眼开’，人在面对高价值的奖励过度兴奋时会瞳孔放大；而在休闲放松时，瞳孔则会缩小。”张永清说。

这一现象能否用于检验突变犬对于环境刺激的反应呢？

为了找到答案，张永清团队与中国科学院深圳先进技术研究院研究员蔚鹏飞团队以及英国林肯大学教授郭昆等合作，开发了适用于家犬的瞳孔测量仪，使用人工智能辅助的瞳孔检测算法，实现了对家犬瞳孔大小的实时测量，以此了解它们在不同环境中的情绪。

利用该测量仪，合作团队检测了在不同刺激条件下的瞳孔大小变化，结果发现了与孤独症患者相一致的瞳孔反应异常。

与普通家犬相比，研究者发现，突变犬面对正常声音刺激时瞳孔放大更明显，表明其对声音更为敏感。而在面对高分贝电子鞭炮声刺激时，突变犬的瞳孔会更快速地放大，并且恢复到正常基线的时间明显延长，表明其被声音惊吓后瞳孔大小需要更长时间恢复正常。

此外，当人与犬同时佩戴瞳孔测量仪进行社交互动时，普通犬与人互动会出现瞳孔缩放的同步化，而突变犬中这种同步化被破坏。“比如在人抚摸时，普通犬瞳孔会与人的瞳孔缩放同步化，但突变犬则不表现这种同步化。而当给予高奖励食物时，普通犬瞳孔会变大，但突变犬的瞳孔变化不明显，对食物反应变小。”蔚鹏飞举例说。

“突变犬的瞳孔反应异常为解析孤独症患者的感知觉异常提供了一个全新的角度，也为孤独症诊断和治疗策略的研发提供了新的检测体系。”张永清说。

“这项研究让人兴奋，用瞳孔的变化表征孤独症患者的情绪变化是一个非常好的生物学指标。”北京大学医学部孤独症研究中心主任于翔评价说，“犬跟人的互动就像人跟人的互动一样，良好的互动会让催产素上升，突变犬对这种互动不敏感也证明了这个模型的有效性，期待犬模型会给诊断和治疗孤独症研究带来更多机会。”

用科学改善生活

与建立家犬孤独症模型一样，繁育突变型家犬也非易事。因为突变后的家犬更易感染、生病，为了更好地照顾它们，参与项目的研究生们几乎天天泡在北京昌平一片农田边的实验室里，8年的磨炼也让他们从最初的“养犬小白”变成了“养犬能手”。

多位专家表示，孤独症犬模型的成功构建，将促进其病理生理机制的阐明，并为开发新的药物和治疗措施提供新的实验体系。

“临床研究非常关注大动物模型，其优势是更有利于观察重要生命体征的变化，这对提升诊断、治疗以及开发药物和医用器械等临床转化研究的成功率至关重要。”首都医科大学副校长、北京脑重大疾病研究院院长吉训明评价说。

到目前为止，利用家犬作为模式动物开展的研究已经获得两次诺贝尔生理学或医学奖，包括1904年巴甫洛夫在消化系统生理学方面取得的开拓性成就，以及1923年弗雷德里克·格兰特·班廷因发现胰岛素而挽救了千千万万的糖尿病患者。

除了建立孤独症家犬模型，近年来，张永清团队还构建了家犬的全脑蛋白质组时空表达图谱，利用实验犬研究了人类动脉粥样硬化与心脑血管疾病的关联。

张永清希望，在“健康中国2030”的大背景下，用科学力量能够改善更多人的生活。

相关论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41380-023-02276-9

https://doi.org/10.1038/s41380-023-02277-8