小RNA是怎样切成的

研究揭示Dicer酶识别切割RNA机制

DCL3-RNA复合物总体结构。图片来源于论文

在包括人类在内的高等真核生物中，有一类长度约为19~30个碱基的小RNA，在调控基因表达、抗病毒以及维持基因组稳定性等一系列重要生理过程中起关键作用。

Dicer核酸内切酶是小RNA生物合成的核心分子，小RNA均为Dicer酶切割前体RNA而成。不同小RNA长度的区别主要依赖于不同Dicer酶的特异性切割。

南方科技大学教授杜嘉木联合深圳大学医学部副教授李思思、美国加利福尼亚大学Steven E. Jacobsen团队以植物DNA甲基化通路中的Dicer酶DCL3为研究对象，首次从整体层面解析了Dicer酶识别和切割RNA的作用机制。相关研究成果发表于10月15日《科学》。

Dicer：重要又神奇的酶

根据来源和功能不同，小RNA可以分为很多类，不同种类的小RNA具备自己特定的长度。如植物中负责转基因沉默的小RNA是21-nt（核苷酸），而负责调控DNA甲基化的小RNA则是24-nt。

杜嘉木告诉《中国科学报》：“这些区别产生的根源在于，小RNA的生成需要一类叫做Dicer的酶去切割前体RNA，而Dicer同时具备‘分子尺’和‘分子刀’的功能，可以测量产物RNA的长度并定点切割前体RNA。”

值得注意的是，不同的Dicer酶可以测量并产生不同长度的小RNA。因此，可以说Dicer是小RNA生物合成的核心分子，它直接确定了所产生小RNA的长度、链特异性以及RNA的末端选择性等关键特征。

Dicer的分子作用机制一直小RNA领域的研究热点，既往研究也获取了Dicer在各个状态下的结构。然而，Dicer是一个动态性非常强的酶。杜嘉木介绍，在催化过程中，Dicer可以和多种辅助因子结合，具备抓取前体RNA、将RNA放置到活性位点并开展定点切割等一系列动态过程。

虽然，既往研究抓到了很多Dicer的状态，但是一直没有观测到切割状态下的Dicer是如何从一侧抓取RNA的末端，并利用自身作为“分子尺”量取特定长度，随后在RNA另一侧定点切割。

杜嘉木指出，此前Dicer切割机制的研究已积累了很多生化数据，为本研究做了重要铺垫。如前期对DCL3的生化研究发现，DCL3作用机制需要其前体RNA的先导链5’端第一个碱基是磷酸化的A，互补链3’端需要有1-nt的末端突出，DLC3可以量取24-nt的小RNA等。

无心插柳：抓到Dicer活性状态

在植物中，DNA甲基化的从头建立需要一个植物特有的信号系统——RNA指导的DNA甲基化，这个系统中采用了长度为24-nt的小RNA作为信号来介导DNA甲基化。

“植物利用Dicer家族成员DCL3特异性生成24-nt的小RNA来介导DNA甲基化。”杜嘉木强调，虽然这个通路在动物体内并不存在，但是动植物在基于Dicer的小RNA生成方面的生化机制相同。

研究人员在研究植物DNA甲基化时，非常幸运地抓到了DCL3的活性状态。

“我们发现DCL3几乎没有结合因子，而其自身的酶活性非常高，非常适合作为模型系统来研究Dicer的测量和切割机制。”杜嘉木说。

为此，研究人员在反应体系中加了钙离子，利用钙离子模拟镁离子催化抑制切割的作用，使DCL3处于结合RNA的状态，又因离子不同无法继续切割，从而卡在切割前的活性状态。

“结果正如我们预测，实验中DCL3-RNA复合物非常幸运地恰好处在Dicer的活性切割状态，从而成功解析了DCL3识别和切割RNA的机制。”杜嘉木说。

杜嘉木表示，本研究在既往研究的基础上，首次从整体层面将这些元素全部整合在一起并在机制上予以解析。

“我们观测到DCL3需要将前体RNA的第一个碱基对打开，从而使前导链和互补链的5’磷酸和3’末端突出，分别插入到Dicer的两个相邻的结合口袋，产生特异性识别。”杜嘉木说。

李思思补充，基于RNA结构的生化性质测定发现，DCL3对5’起始的测量更加敏感，而对3’起始的测量具备较高的容错性。“为了证明这个推论，我们设计出不同的RNA并开展酶活实验，并证实了Dicer确实更依赖于5’起始测量RNA的机制，证实了基于结构的推论。”

在切割层面，该研究还首次观测到了RNA处在Dicer的活性中心的构象，观测到了活性状态Dicer扭曲RNA，并对RNA的前导链和互补链相差2-nt同时切割的状态，解释了体内DCL3产物总是一条24-nt、另一条23-nt的原因。

“因为DCL3下游的AGO4蛋白只识别24-nt的RNA，因此该结果也解释了前期观测到的，RNA指导的DNA甲基化中小RNA的不对称性产生现象。”杜嘉木说。

人造Dicer或许“触手可及”

Dicer酶的作用机制是小RNA合成的核心。该研究在解析植物DCL3作用机制的过程中，也大量借鉴了动物Dicer研究的成果，从另一个侧面展示出Dicer家族酶在机制层面具有相当强的保守性。

李思思向《中国科学报》表示，小RNA是未来潜在的疾病治疗手段，很多基于小RNA的治疗策略正在研发中。

“人的Dicer与很多疾病相关，也是目前基于RNA干扰疗法的核心。”杜嘉木表示，本研究不仅解析了植物DCL3特异性产生24-nt小RNA的机制，也在很大程度上对动物Dicer、特别是人Dicer的作用机制有很大的提示作用，这对未来RNA干扰疗法的发展及设计都有非常重要的意义。

目前，对Dicer-RNA互作机制的应用都是基于天然Dicer而设计的。李思思认为，如何避免内源性Dicer的作用是关键问题。

基于该研究所揭示的Dicer-RNA互作机制，使得人为改造设计人工Dicer-RNA成为可能。“这样，就可以在不影响体内Dicer正常工作的情况下，选择性切割特定RNA，这为未来Dicer的应用研究提供了一个新窗口和新思路。”李思思说。

杜嘉木介绍，下一步，课题组将继续设计不同的RNA，力求获取DCL3抓到RNA以及将RNA放到活性位点前的状态，完整的解析Dicer的作用机制。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1126/science.abl4546